由于膠原是細胞外間質(zhì)成分bai，在體du內(nèi)以不溶性大分子結(jié)構(gòu)存在，zhi并與蛋白多糖、糖蛋白等結(jié)合在一起，dao因此膠原的制備包括材料的選擇、預(yù)處理、酸堿酶鹽水法提取、不同類型膠原的分離和純化。 除膠原蛋白外，動物骨中還含有油脂、多種礦物質(zhì)和其他雜質(zhì)，因此在被用于提取膠原蛋白之前必須進行預(yù)處理。先剔除動物骨上殘留的肉質(zhì)和肌腱等雜物，粉碎后用正丁醇或正己烷萃取出骨油。最后除去骨中無機物以提高膠原蛋白的得率。除去骨中的礦物質(zhì)可用稀酸或EDTA溶液。有人用原料用5倍質(zhì)量的1.0moL/LHCL脫鈣處理2d，用正乙烷脫脂后再用胃蛋白酶酶解，在加酶量150U/g，pH值1.7，37℃條件下處理120min，然后在固液比1∶6的情況下抽提5h，在此條件下，提取率可達18%；還有人用EDTA溶液（pH7.4）浸泡骨料5d，可有效脫去骨料中的羥基磷灰石。

膠原蛋白的提取一般有三種方法：一是高壓輔助的物理方法；二是用溶劑預(yù)處理結(jié)合低溫或熱水抽提的化學(xué)方法，根據(jù)溶劑的不同，可分為熱水浸提法、酸法、堿法、鹽法；三是用酶的生物化學(xué)法。一般來說，高壓輔助和熱水抽提針對明膠的提取，而低溫抽提和酶法針對膠原的提取，但其基本原理都是根據(jù)膠原蛋白的特性改變蛋白質(zhì)所在的外界環(huán)境，把膠原蛋白從其他蛋白質(zhì)中分離出來。

在實際提取過程中，不同提取方法之間往往相互結(jié)合，可以得到較好的提取效果。采用超高壓處理系統(tǒng)對原料給予高壓處理一段時間，使其組織結(jié)構(gòu)和膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)發(fā)生松弛、變性，便于分離提取。 酸法提取是利用一定濃度的酸溶液在一定的條件下提取膠原蛋白，主要采用低離子濃度酸性條件破壞分子間鹽鍵和希夫堿，而引起纖維膨脹、溶解，采用酸法提取的膠原蛋白通常成為酸溶性膠原蛋白。酸溶解法可將沒有交聯(lián)的膠原分子溶解出來，也可溶解含有醛胺類交聯(lián)鍵的膠原纖維，然后釋放到溶劑中。酸法是提取膠原蛋白比較常用和有效的方法，用低溫酸法提取的膠原最大程度的保持了其三螺旋結(jié)構(gòu)，適用于醫(yī)用生物材料及原料的制備。通常的做法是將適當(dāng)濃度的酸液按一定料液比加入到經(jīng)過預(yù)處理的骨粉中，于0～25℃攪拌提取一定時間。在采用酸法進行膠原蛋白的提取時，注意提取溫度不宜過高，以免膠原蛋白的生物活性發(fā)生破壞。取樣經(jīng)前處理后，勻漿在低溫下用酸浸提，離心即可得酸溶性膠原蛋白（acid-soluble collagen，ASC）。作為溶劑使用的酸，主要有鹽酸、磷酸、甲酸、乙酸、蘋果酸、檸檬酸等，但大多數(shù)研究集中于乙酸抽提，像Maria Sadowska等用0.5mol/L檸檬酸在室溫下提取骨膠原蛋白，其提取率略低于乙酸提取。檸檬酸因不產(chǎn)生顏色和異味得以廣泛使用于食品工業(yè)的膠原蛋白的提取。

酸法處理時，反應(yīng)強烈，水解徹底，多生成氨基酸混合物，而且使用酸提取時，根據(jù)酸濃度、水解溫度、水解時間等條件的不同，可以得到分子量不均的膠原水解物。但是在即使中等濃度酸徹底水解過程中色氨酸也會全部被破壞，絲氨酸和酪氨酸也會部分被破壞，且設(shè)備腐蝕嚴重。因此，酸法溶出生物醫(yī)用膠原要準確控制酸度、溫度、時間等影響因素。由于各種不足，酸法很少單獨使用，一般和酶法配合。比如以豬皮為原料，在檸檬酸(pH8.6)和胃蛋白酶協(xié)同下提取膠原蛋白。在處理后的豬皮中加0.05moL/L含有胃蛋白酶的檸檬酸溶液（pH2.5-3）處理一段時間，然后再用NaCL鹽析，最后提取率為12.35%，提取物保持了完整三股螺旋結(jié)構(gòu)的I型膠原蛋白。還有人以雛雞胸軟骨為原材料，在0.5moL/L醋酸條件下經(jīng)胃蛋白酶多次消化，在4℃，20000r條件下離心20min，最后應(yīng)用DEAE-Sephadex A-50進行離子交換層析，之后透析，再用NaCL鹽析，最后得到純化的膠原蛋白Ⅱ型。 堿法提取即利用一定濃度的堿在一定的外界條件下提取膠原蛋白，堿處理法中常用的處理劑為石灰、氫氧化鈉、碳酸鈉等，用氫氧化鈉浸提時效果較好。一般的是把樣品勻漿后，用堿溶液多次溶脹后，再離心提取。但由于易引起蛋白質(zhì)變性，如膠原肽鍵水解，含羥基、疏基的氨基酸全部被破壞；所得產(chǎn)物等電點pH值較低，天冬酞胺和谷氨酞胺分別轉(zhuǎn)變?yōu)樘於彼岷凸劝彼?，得到的水解產(chǎn)物分子量較在酸性溶液中比低等問題，若比較嚴重的話，還會產(chǎn)生 D、L-型氨基酸消旋混合物，若D型氨基酸含量高過L 型氨基酸，則會抑制L-型氨基酸的吸收，有些D型氨基酸有毒，甚至有致癌、致畸和致突變的作用。而且堿法提取的含量較低，用氫氧化鈉從魷魚皮中提取堿溶性膠原蛋白，其得率只有3%（以濕基計）。所以，若想提取結(jié)構(gòu)完整、使用安全的膠原蛋白，很少采用此方法。有關(guān)單獨采用堿法提取膠原蛋白的報道不多，一般是堿法提取和酸法提法結(jié)合使用。比如在4℃條件下，魚骨用0.1moL/L的NaOH浸泡6h，再用2.5%NaCl浸泡6h去除雜蛋白，用10%的異丙醇溶液去除脂肪，0.1moL/L的檸檬酸浸泡3d，最后得到無色無味的膠原蛋白，提取率為11.87%。

注意，無論酸法或堿法，均可有效地提取膠原蛋白，有人分別采用醋酸- 鹽酸的混合酸液（pH3.0）和NaOH溶液（pH12.0）提取骨膠原蛋白，提取率基本相當(dāng)。但是，這兩種方法提取膠原蛋白不僅容易影響膠原蛋白的生物活性，而且提取后產(chǎn)生的酸性或堿性廢液必須進行適當(dāng)處理，以避免對環(huán)境造成污染。 酶法提取是指可溶性膠原和酸溶性膠原被提取后，需用一些蛋白酶，如膠原酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰凝乳蛋白酶等水解，得到不同的酶促溶性膠原蛋白。所使用的蛋白酶主要分3種：動物蛋白酶（如胰蛋白酶，胃蛋白酶），植物蛋白酶（如木瓜蛋白酶，菠蘿蛋白酶），微生物蛋白酶（如堿性蛋白酶，中性蛋白酶）。在對酶法水解膠原蛋白的研究中，以堿性蛋白酶應(yīng)用最多。

將膠原進行限制性降解，即將末端肽切割下來，由于膠原肽鏈間的共價鍵都是通過分子末端肽里的賴氨酸或羥賴氨酸的相互作用形成的，末端肽被切下后，含三螺旋結(jié)構(gòu)的主體部分可溶于稀有機酸而被提取出來。用酶處理，可以水解掉膠原纖維蛋白的末端肽，提高膠原蛋白的產(chǎn)率；而且還不會破壞膠原蛋白的三股螺旋結(jié)構(gòu)，保持其特性。影響酶提取的因素有很多，如酶濃度、酶與底物的比例、酶解時間、酶解溫度、pH值以及料液比等。在實際操作中，大多數(shù)采用酶復(fù)合法提取膠原蛋白，較多的是使用胃蛋白酶提取，有機酸多為乙酸。

酶解膠原蛋白的工藝主要分為單酶水解法和多酶水解法。多酶水解法又分為混合酶水解法（比如牛胰蛋白酶，鏈霉菌蛋白酶，芽孢桿菌蛋白酶混合）和分步酶水解法，酶法提取皮膠原具體實驗工藝及條件的選取通常應(yīng)考慮要開發(fā)的產(chǎn)品對分子量的要求，要得到分子量較小的膠原多肽一般采用多酶水解法。影響酶解效果的因素主要有：酶的種類、加酶量、酶解溫度、酶解時間、pH值及料水比。采用酶法提取骨料中的膠原蛋白，既能有效縮短提取時間，又能獲得具有良好生物活性的膠原蛋白，而且對環(huán)境的污染也較小。膠原蛋白不易被普通蛋白酶水解，但能被動物膠原酶斷裂，斷裂的碎片自動變性后可被普通蛋白酶水解。胃蛋白酶水解膠原蛋白的適宜條件為pH 1.65～1.70、溫度37℃。

有人以豬骨為原料，用蛋白酶的酶解反應(yīng)代替?zhèn)鹘y(tǒng)制膠工藝，對骨膠原的酶解反應(yīng)與酶法制膠工藝進行了試驗研究。結(jié)果表明：以胃蛋白酶對骨膠原的提取率最高（46.14%），其次是胰蛋白酶（43.42%），接下來是中性蛋白酶（30.14%），最后是堿性蛋白酶（21.15%）。并且通過單因素和正交試驗對胃蛋白酶酶解反應(yīng)中各主要影響因素進行了優(yōu)化。試驗結(jié)果表明，胃蛋白酶提取的最優(yōu)條件是，胃蛋白酶的濃度是1%，在pH2.0的條件下酶解48h，然后在濃度為10%（w/v）的NaCL溶液中鹽析24h，最后骨膠原的回收率為64.77%，骨膠原的提取率為49.75%。還有人用胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白，分別在水解0、2、6、10、14、18、22、26h時對四種不同胃蛋白酶用量（分別為1%、2%、2.5%、3%）的試樣取樣檢測，采用一階HILL方程模擬胃蛋白酶提取豬皮膠原蛋白的進程以及胃蛋白酶水解速率的衰減過程，最后得出2%的胃蛋白酶用量和6-7h的水解時間提取率最大。還有人用以新鮮豬皮為原料，在50-52℃的條件下用胰酶進行水解，在酶用量為 5000：1～10000：1，pH值為9，反應(yīng)2－3h，原料：水為1：2的條件下酶解。結(jié)果表明：總蛋白質(zhì)的提取率≥80%。

采用酶法提取膠原蛋白時，必須嚴格控制提取條件。首先，酶作用時間必須適當(dāng)。如果時間過短，膠原蛋白就不能充分釋放到提取液中，影響提取率；如果酶作用時間過長，膠原蛋白會水解過度，產(chǎn)生過多的苦味小分子低聚肽，不僅會增加分離純化的難度，也會影響膠原蛋白的功能特性和生物活性。其次，酶解溫度要適宜。溫度過低，酶的作用效果不明顯；溫度過高會引起酶的失活和膠原蛋白的變性。據(jù)報道，當(dāng)介質(zhì)pH略低于中性時，膠原蛋白的變性溫度為40～41℃，當(dāng)介質(zhì)pH為酸性時，膠原蛋白的變性溫度為38～39℃，而且魚皮膠原蛋白的變性溫度要比豬皮膠原蛋白的變性溫度低7～12℃。所以，如果要使提取的膠原蛋白具有良好的生物活性，在提取過程中應(yīng)使提取溫度低于變性溫度。第三，需選用適當(dāng)?shù)拿?。一般從陸生哺乳動物組織中提取膠原蛋白時，采用胃蛋白酶在其最適作用溫度下進行提取是合理的，但對于魚類等水生動物，由于其膠原蛋白的變性溫度比陸生哺乳動物低，因此許多蛋白酶便不適用，如果在這些酶的最適作用溫度下提取可能會破壞膠原蛋白的某些功能特性和生物活性。采用酶法提取膠原蛋白及其多肽的研究主要是從動物皮及其加工副產(chǎn)物中，應(yīng)用酶法從動物骨中提取膠原蛋白及其多肽報道較少。 指使膠原分子內(nèi)部和分子間通過共價健結(jié)合提高膠原纖維的張力和穩(wěn)定性的方法。該法又分為物理方法、化學(xué)方法和低溫等離子體法，生物學(xué)方法；其中物理方法、化學(xué)方法是最常用的交聯(lián)改性方法，生物學(xué)方法改性膠原蛋白主要在研究有關(guān)動物老化的生命現(xiàn)象中涉及，在研制膠原基生物醫(yī)學(xué)材料中少見報道。

物理方法

通過物理手段對膠原蛋白改性有紫外線照射、重度脫水、λ射線照射和熱交聯(lián)等方法。膠原溶液如被紫外線等照射，將在分子間產(chǎn)生交聯(lián)，粘度增加，生成凝膠。常用的紫外線交聯(lián)膠原膜的方法是將膠原膜放在鋁箔上，距離254 nm紫外燈20 cm高度，照射1～5 h。對紫外線照射的膠原膜進行力學(xué)性能和膠原酶試驗表明：交聯(lián)膠原膜的萎縮溫度Ts和抗膠原酶解的能力均顯著高于未交聯(lián)膠原膜。

重度脫水也是膠原蛋白物理改性中常使用的方法，該法是通過脫水導(dǎo)致膠原分子間交聯(lián)，從而增加變性溫度，改善膠原的性能。改性后膠原膜生物相容性提高，降低了水溶性，影響了膜與成骨細胞的生物相容性。物理方法改性原蛋白的優(yōu)點是可避免外源性有毒化學(xué)物質(zhì)進入膠原內(nèi)，缺點是膠原膜交聯(lián)度低，且難以獲得均勻一致的交聯(lián)。

化學(xué)方法

化學(xué)方法比物理方法改性交聯(lián)度高，且能獲得均勻一致的交聯(lián)，對調(diào)節(jié)、控制膠原的各性質(zhì)均有效。已廣泛應(yīng)用于各種化學(xué)試劑交聯(lián)膠原，以提高其交聯(lián)度、力學(xué)性能及生物相容性。化學(xué)改性法具體又可分為使用化學(xué)試劑交聯(lián)、側(cè)鏈的修飾、生理活性物的固定化三種方法。

化學(xué)試劑交聯(lián)法中常用的化學(xué)交聯(lián)劑有戊二醛、己異二氰酸酯、碳化二亞胺、疊氮二苯基磷等，其中戊二醛是應(yīng)用最廣泛的試劑，大量實驗證明：戊二醛能提供有效交聯(lián)，但有細胞毒性，且其用量難以控制。另外，隨著交聯(lián)度的增加，吸水能力和膨脹度卻會降低。?；B氮化物、聚環(huán)氧化物或京尼平交聯(lián)等，不會引入明顯的毒性，且可獲得理想的交聯(lián)效果。所見報道中，多使用單一交聯(lián)劑對膠原蛋白交聯(lián)改性，但也有使用混合交聯(lián)劑的，如為了解決人工心臟瓣膜晚期鈣化問題，篩選出環(huán)氧丙烷化學(xué)改性戊二醛處理生物瓣的方法，可明顯減低瓣膜組織膠原蛋白末端游離羧基含量。動物實驗表明，經(jīng)改性后的瓣膜組織能保持較好的組織穩(wěn)定性和機械抗張強度、免疫原性測試為陰性，符合臨床應(yīng)用。

側(cè)鏈修飾就是對膠原分子側(cè)鏈的氨基和羧基進行化學(xué)修飾，改善電荷分布，使膠原獲得新的特性，例如將膠原氨基丁二?；?，可變成負電荷豐富的膠原。與未修飾膠原蛋白相比血小板粘附能，血纖維蛋白形成能都弱，有抗栓性；然而如將膠原羧基甲基化獲得的正電荷豐富的膠原，生理條件下血小板粘附能、活化能都高。與交聯(lián)改性相比，在生物材料領(lǐng)域，利用側(cè)鏈修飾對膠原改性所做的工作還較少。

化學(xué)方法雖然可獲得均勻一致的交聯(lián)，但存在著引入外源有毒試劑，殘留試劑難清除等缺點。一些報道表明，低溫等離子體技術(shù)改性膠原或膠原復(fù)合膜可使材料表面引入不同基團，改變材料表面化學(xué)組分和結(jié)構(gòu)，從而改變材料的特性，如使之geng具有細胞識別位，提高表面能，改善表面極性等。 膠原單獨使用，物理機械性能差（這幾乎是天然材料共有的弱點），性能單一，且因有親水性強，在體內(nèi)易被膠原酶降解等不可避免的弱點限制了它的應(yīng)用。但如將膠原與其它物理、化學(xué)性質(zhì)不同的合成或天然高分子共混，組成一種多相固體材料，在性能上膠原與其它高分子互相補充，膠原基“復(fù)合材料”的概念由此產(chǎn)生。

已見報道的與膠原共混的合成高分子有不可生物降解的聚甲基烯酸酯及丁烯酸酯、聚氨酯、聚酰胺和可生物降解的聚乙烯醇、聚乳酸、聚谷氨酸、聚乙醇酸等，20世紀80～90年代初最有代表性的是聚甲基丙烯酸羥乙酯（PHEMA）和聚乙烯醇與膠原共混，其報道集中于復(fù)合方法、復(fù)合機理、理化及生物學(xué)性能、材料表面和整體結(jié)構(gòu)、表面修飾的方法和機理以及水凝膠的溶脹擴散等，尤其是水凝膠制備、作軟組織替代、藥物緩釋等。后來利用可生物降解的聚乳酸、聚乙醇酸、聚酸酐、聚谷氨酸、聚亞乙基四乙酸等與膠原共混改性制備可吸收外科縫線、組織工程支架材料（如組織引導(dǎo)再生材料）的相關(guān)研究相對增多。不過合成高分子與膠原蛋白共混復(fù)合一些問題，如尼龍等不降解高分子材料不能進行生理代謝，與膠原蛋白復(fù)合后只能用做皮膚的外層敷料不能永久代替皮膚，而聚谷氨酸等可生物降解材料，如果相對分子質(zhì)量小則強度不夠，相對分子質(zhì)量大難溶于水，溶解時還出現(xiàn)降解，影響材料的機械強度。

天然高分子材料中最具代表性的是天然蛋白質(zhì)和天然多糖，多糖主要有軟骨素、HA（透明質(zhì)酸）、殼聚糖、肝素等，多糖復(fù)合材料比較集中于可吸收性外科縫線、藥物釋放的載體、皮膚替代物、透析膜、止血劑、醫(yī)用引導(dǎo)組織再生材料、骨替代材料、組織培養(yǎng)系統(tǒng)的支架。