體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個(gè)體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相同，現(xiàn)介紹個(gè)別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下：

    一、上皮細(xì)胞培養(yǎng)

    上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中?；祀s有成纖維細(xì)胞，培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度往往超過(guò)上皮細(xì)胞，并難以純化，同時(shí)上皮細(xì)胞難以在體外長(zhǎng)期生存，因此純化和延長(zhǎng)生存時(shí)間是培養(yǎng)關(guān)鍵。

    體內(nèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原構(gòu)成的基膜，因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長(zhǎng)，另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時(shí)，細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2 含量和溫度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子，均有利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。

    以表皮細(xì)胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）

    1、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5-1平方厘米小塊。

    2、置0.02?A中，室溫，5分鐘。

    3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過(guò)夜。

    4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開(kāi)。

    5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30-60分鐘。

    6、反復(fù)吹打，制成懸液。

    7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸去上清。

    8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。

    二、內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)

    內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞，對(duì)于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞再生、腫瘤促血管生長(zhǎng)因子（TAF）等有很大價(jià)值。

    研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡(jiǎn)便，其法如下：

    1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無(wú)菌剪取10―15厘米長(zhǎng)一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時(shí)內(nèi)保存于4℃。

    2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。

    3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿血管，消化3-10分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。

    4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復(fù)）。

    5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)成單層。

    三、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)

    神經(jīng)細(xì)胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí)，可出現(xiàn)一定程度的分化，長(zhǎng)出突起等現(xiàn)象，但很難使之增殖。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。

    人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞，也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說(shuō)來(lái)，膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對(duì)外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。

    培養(yǎng)方法如下：

    1、從手術(shù)室無(wú)菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)后，仔細(xì)剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks液中漂洗一、二次。

    2、置于30―50倍體積的Hanks液中，此時(shí)腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即制成細(xì)胞懸液。

    3、把懸液注入離心管室溫中直立5-10分鐘后，細(xì)胞或細(xì)胞團(tuán)快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反復(fù)二、三次，即可排除脂肪成分和其它碎塊并獲較多細(xì)胞成分。

    4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液，通過(guò)紗網(wǎng)成紗布過(guò)濾，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞密度。

    5、接入培養(yǎng)瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養(yǎng)。

    該細(xì)胞適應(yīng)環(huán)境過(guò)程較長(zhǎng)，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內(nèi)也可能不見(jiàn)細(xì)胞分裂現(xiàn)象，然而一旦生長(zhǎng)后即能迅速進(jìn)入旺盛的增殖狀態(tài)。細(xì)胞傳代可以0.25%胰酶消化處理。

    四、肌組織培養(yǎng)

    各種肌組織均可用于培養(yǎng)，以心肌和骨骼肌較實(shí)用。

    （－）骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)

    1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。

    2、無(wú)菌取大腿肌組織，切成0.3-0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無(wú)菌紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)。

    3、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度。

    4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。

    5、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。

    接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。

    該細(xì)胞接種率約50%，細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始呈紡錘形，培養(yǎng)50-52小時(shí)后出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止，此時(shí)可觀察到橫紋，一般在融合后二、三天內(nèi)能見(jiàn)到收縮現(xiàn)象。

    （二）心肌細(xì)胞培養(yǎng)

    心肌細(xì)胞是最早的培養(yǎng)材料，Carrel曾長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物，最常用的是雞胚心肌。

    心肌比較容易培養(yǎng)和生長(zhǎng)，可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法，均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好，原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形，培養(yǎng)成功時(shí)，一周后可見(jiàn)節(jié)律性收縮現(xiàn)象。

    五、巨噬細(xì)胞培養(yǎng)

    巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞，有多種功能，是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得，便于培養(yǎng)，并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群，在條件適宜下可生活2-3周，多用做原代培養(yǎng)，難以長(zhǎng)期生存。

    巨噬細(xì)胞也建有無(wú)限細(xì)胞系，大多來(lái)自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。

    培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來(lái)源來(lái)獲取細(xì)胞，以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用，其法如下：

    1、實(shí)驗(yàn)前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無(wú)菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內(nèi)！），以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。

    2、引頸處死小鼠。

    3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3-5秒。

    4、置動(dòng)物于解剖臺(tái)，用針頭固定四肢，持鑷撕開(kāi)腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜壁。

    5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時(shí)用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內(nèi)流動(dòng)。

    6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè)．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。

    7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。

    8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養(yǎng)基。

    9、計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生20-30×106細(xì)胞，其中90%為巨噬細(xì)胞。

    10、以3×105個(gè)貼附細(xì)胞/平方厘米接種。

    11、接種數(shù)小時(shí)后，除去培養(yǎng)液，可去除其它白細(xì)胞，純化培養(yǎng)細(xì)胞，用Eagle液沖洗1-2次，再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。

    六、腎小球分離、移植培養(yǎng)

    SD 大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡1～2分鐘，2次，置超凈臺(tái)內(nèi)，打開(kāi)腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank's液的無(wú)菌培養(yǎng)皿洗滌，置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過(guò)篩網(wǎng)，濾過(guò)組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過(guò)，去小組織塊，濾過(guò)物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng)，輕輕濾過(guò)，Hank's液洗滌1次，收集網(wǎng)上腎小球，鏡下觀察為分離良好的腎小球。腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應(yīng)，離心除去膠原酶。處理過(guò)的腎小球計(jì)數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶，使腎小球大于60個(gè)/cm2，加培養(yǎng)基5～10ml（培養(yǎng)基組成：F12―3T3上清1：1；5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素5μg/ml；25ng/ml氫化可的松；5μg/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養(yǎng)8～10天，去除腎小球未生長(zhǎng)組分，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 小時(shí)，形態(tài)學(xué)觀察：細(xì)胞生長(zhǎng)成單層多角型細(xì)胞，直徑約100μm。

    七、裸小鼠移植瘤單細(xì)胞分離培養(yǎng)

    無(wú)菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時(shí)，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘，在消化過(guò)程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個(gè)注射器中間加一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細(xì)胞）來(lái)回推動(dòng)注射器吹打組織以分離單細(xì)胞，終止酶消化方法同上。常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細(xì)胞。