試劑、試劑盒 封閉緩沖液 封閉液 細(xì)胞懸浮緩沖液 抗體 LB 培養(yǎng)基

儀器、耗材

Sorval GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)轉(zhuǎn)子 適用于處理細(xì)菌的超聲波破碎儀 大腸桿菌 Y1090 hsdR

材料

緩沖液和溶液

貯存緩沖液和試劑的組分請(qǐng)見(jiàn)時(shí)錄 12。

將貯存液稀釋到適當(dāng)?shù)臐舛取?br>
封閉緩沖液

10 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

150 mmol/L NaCl

0.05%(V/V)Tween-20

封閉液（1%m/V 明膠,3%m/V 牛血清白蛋白，或 5%m/V 脫脂奶粉）

這些封閉試劑的優(yōu)點(diǎn)，不同實(shí)驗(yàn)室備執(zhí)一詞。我們建議使用者進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)確定哪種封閉液與所選擇的第一抗體和第二抗體匹配最-優(yōu)。封閉液可以貯存于 4°C，重復(fù)使用數(shù)次。加人終濃度為 0.05%(m/V）的疊氮-化鈉用以抑制微生物的生長(zhǎng)。

細(xì)胞懸浮緩沖液

50 mmol/L Tris-Cl(pH8.0)

10 mmol/L EDTA(pH8.0)

過(guò)濾除菌，以 50 ml 等分后貯存于 4°C。

抗體

制備用于文庫(kù)篩選的抗體

培養(yǎng)基

LB 培養(yǎng)基

離心機(jī)和轉(zhuǎn)子

Sorval GSA 轉(zhuǎn)子或相當(dāng)轉(zhuǎn)子

專用設(shè)備

適用于處理細(xì)菌的超聲波破碎儀

載體和菌株

大腸桿菌 Y1090 hsdR

該菌株可以從 Stratagene,Life Technologies 或 ATCC(www，atcc.org) 獲得。

方法

1. 在 LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng) 100 ml 大腸桿菌 Y1090 hsdR 株達(dá)到飽和。

2. 于 4°C 以 5000 g 離心10min 收獲細(xì)菌。

3. 細(xì)菌重懸于 3 ml 細(xì)菌懸浮緩沖液中。反復(fù)凍融數(shù)次，再于 0°C 用最大功率超聲波處理 6 次，每次 20s。

4. 提取液于 4°C 以 12000g 離心 10 min, 將上清液轉(zhuǎn)移到另一試管內(nèi)，所得裂解液貯存于-20°C。

5. 使用裂解液前先用封閉液以 1:10 稀釋用于篩選的抗體制劑。