外植體滅菌是植物細(xì)胞組織培養(yǎng)重要的工作之一。接種用的材料表面，常常附有多種多樣的微生物，這些微生物一旦帶進(jìn)培養(yǎng)基，就會(huì)迅速滋生，使實(shí)驗(yàn)前功盡棄。因此，材料在接種前必須進(jìn)行滅菌。滅菌時(shí)，既要將材料上附著的微生物殺死，同時(shí)又不能傷及材料。因此，滅菌采用何種藥劑，什么濃度，處理多長(zhǎng)時(shí)間，均應(yīng)根據(jù)材料對(duì)藥劑的敏感情況來(lái)確定。

與滅菌相關(guān)的一個(gè)概念是消毒，它指殺死、消除或充分抑制部分微生物，使之不再發(fā)生危害作用，顯然經(jīng)過(guò)消毒，許多細(xì)菌芽孢、霉菌的厚垣孢子等不會(huì)完全殺死，即由于在消毒后的環(huán)境里和物品上還有活著的微生物，所以通過(guò)嚴(yán)格滅菌的操作空間(接種室、超凈臺(tái)等)和使用的器皿，以及操作者的衣著和手都不帶任何活著的微生物。在這樣的條件下進(jìn)行的操作，就叫作無(wú)菌操作。一般來(lái)說(shuō)，外植體接種的過(guò)程都是在無(wú)菌的環(huán)境里進(jìn)行的，因此，外植體接種前都必須徹底滅菌。

用于植物外植體滅菌的滅菌劑有升汞、甲醛、過(guò)氧化氫、高錳酸鉀、來(lái)蘇兒、漂白粉、次氯酸鈉、抗生素、酒精等。使用這些滅菌劑，都能起到表面殺菌的作用?，F(xiàn)將主要滅菌劑常用濃度和滅菌效果列出，其中70％～75％的酒精有較強(qiáng)的殺菌力、穿透力和濕潤(rùn)作用，可排出材料上的空氣，利于其他消毒劑的滲入，常與其他消毒劑配合使用。酒精穿透力強(qiáng)，易損傷材料，所以一般處理時(shí)間要短。

上述滅菌劑應(yīng)在使用前臨時(shí)配制，氯化汞可短期內(nèi)貯用。次氯酸鈉和次氯酸鈣都是利用分解產(chǎn)生氯氣來(lái)殺菌的，故滅菌時(shí)用廣口瓶加蓋較好；升汞是用重金屬汞離子來(lái)滅菌的；過(guò)氧化氫是分解釋放原子態(tài)氧來(lái)殺菌的，這種藥劑殘留的影響較小，滅菌后用無(wú)菌水漂洗3～4次即可；由于用升汞液滅菌的材料，難以對(duì)升汞殘毒有效去除，所以應(yīng)當(dāng)用無(wú)菌水漂洗8～10次，每次不少于3min，以盡量去除殘毒。

滅菌時(shí)，把瀝干的植物材料轉(zhuǎn)放到燒杯或其他器皿中，記好時(shí)間，倒入滅菌溶液，不時(shí)用玻璃棒輕輕攪動(dòng)，以促進(jìn)材料各部分與消毒溶液充分接觸，驅(qū)除氣泡，使滅菌徹底。在快到時(shí)間之前1～2min，開(kāi)始把滅菌液傾入一備好的大燒杯內(nèi)，要注意勿使材料倒出，傾凈后立即倒入無(wú)菌水，輕攪漂洗。滅菌時(shí)間是從倒入消毒液開(kāi)始，至倒入無(wú)菌水時(shí)為止。記錄時(shí)間還便于比較滅菌效果，以便改正。滅菌液要充分浸沒(méi)材料，寧可多用些滅菌液，切勿勉強(qiáng)在一個(gè)體積偏小的容器中使用很多材料滅菌。

在滅菌溶液中加吐溫80效果較好，這些表面活性劑主要作用是使藥劑更易于展布，更容易浸入到滅兩的材料表面。但吐溫加入后對(duì)材料的傷害也在增加，應(yīng)注意吐溫的用量和滅菌時(shí)間，一般加入滅菌液的0．5％，即在100mL加入15滴。

最后一步是用無(wú)菌水漂洗，漂洗要每次3min左右，視采用的消毒液種類，漂洗3～l0次。無(wú)菌水漂洗作用是免除消毒劑殺傷植物細(xì)胞的副作用。
 

外植體的滅菌工作應(yīng)在接種室或接種箱內(nèi)無(wú)菌的條件下進(jìn)行，各種不同類型的材料滅菌方法如下，

(1)花藥的滅菌用于組織培養(yǎng)的花藥，按小孢子發(fā)育時(shí)期要求，實(shí)際上大多沒(méi)有成熟，花藥外而有萼片、花瓣或穎片、稃片保護(hù)著，通常處于無(wú)菌狀態(tài)。所以一般只對(duì)整個(gè)花蕾或幼穗進(jìn)行體表滅菌即可。如茄(solanumrnelongennaL)的花藥，滅菌時(shí)先去掉花蕾的萼片，用70％酒精擦洗花瓣，然后將整個(gè)花蕾浸泡在飽和漂白粉上清液中10min，再經(jīng)無(wú)菌水清洗2～3次，即可接種。這一滅菌程序，也適用于其他植物花藥的滅菌。

(2)果實(shí)和種子的滅菌根據(jù)果實(shí)和種子清潔程度，用自來(lái)水沖洗10～20min甚至更長(zhǎng)時(shí)間，然后進(jìn)行消毒。

莢果的滅菌；綠色莢果可以采用火焰殺菌法。將綠色莢果稍加洗滌，轉(zhuǎn)入95％酒精中，然后取出莢果放入滅菌的培養(yǎng)皿中，點(diǎn)燃灼燒，并不斷翻轉(zhuǎn)莢果，待表面酒精燃盡，即可獲得無(wú)菌莢果。再在無(wú)菌條件下取出幼胚或種子用于接種。火焰滅菌具有簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、徹底之優(yōu)點(diǎn)。該程序也適用于塊根類外植體的滅菌。

種子滅菌：通常首先用熱水浸種，然后再用次氯酸鈉或氧化汞等殺菌劑滅菌。熱水浸種除具有增加種皮透性、打破種子的休眠、促進(jìn)種子萌發(fā)的作用外，高水溫也有一定的殺菌作用。浸種的水溫和時(shí)間與種子的大小、干燥程度以及種皮厚度有關(guān)。

具體步驟是用自來(lái)水沖洗10～20min，再用75％酒精消毒1～2min，再用2％次氯酸鈉溶液浸泡5min，后用無(wú)菌水沖洗3～5次，就可以去除種子的病菌，進(jìn)行組織培養(yǎng)。

果內(nèi)種子則先要用10％次氯酸鈣浸泡20～30min，甚至幾小時(shí)，依種皮硬度而定。對(duì)難以消毒的還可以用0．1%升汞或1％～2%溴水消毒5min。對(duì)用胚或胚乳培養(yǎng)的種子，如種皮太硬的種子，也可預(yù)先去掉種皮，再用4％～8％的次氯酸鈉溶液浸泡8～l0min，經(jīng)過(guò)無(wú)菌水沖洗后。在無(wú)菌條件下取出外植體即可用于接種，這類外植體一般都不帶污染微生物。

(3)莖尖、莖段及葉片的滅菌滅菌方法與花藥的滅菌方法相同。對(duì)于莖葉，因?yàn)楸┞对诳罩?，且生有毛或刺等附屬物，所以滅菌前?yīng)該用自來(lái)水沖洗干凈，用吸水紙將水吸干，再用70％酒精漂洗一下。然后，根據(jù)材料的老、嫩和枝條的堅(jiān)硬程度，用2％～10％次氯酸鈉溶液浸泡6～15min，用無(wú)菌水沖洗3次，用無(wú)菌紙吸干后進(jìn)行接種。

(4)根和貯藏器官的滅菌這類材料大多埋于土中，材料上常有損傷及帶有泥土。滅菌比較困難。滅菌前，要用自來(lái)水清洗，并用毛刷或毛筆輕輕刷洗掉污物，必要時(shí)用刀片切去損傷和污染嚴(yán)重部分，吸于多余水分后用70％酒精漂洗一下，再用0．1％～0．2％的氯化汞滅菌5～10min，或用6％～8％次氯酸鈉溶液浸5～15min，接著用無(wú)菌水清洗及用無(wú)菌紙吸干，然后進(jìn)行接種。