染料配基法

實(shí)驗(yàn)方法原理

選擇純化特異蛋白質(zhì)的適宜染料一般是通過反復(fù)試驗(yàn)比較后決定。Cibacron Blue F3GA，作為該領(lǐng)域的先驅(qū)染料與煙酰胺腺嘌呤二核苷酸很相似，并且一直用于純化激酶、水解酶、聚合酶和其他核苷酸依賴的蛋白質(zhì)。但是這種結(jié)合特異性不是絕對(duì)的，Cibacron Blue 也用于不具有核苷酸結(jié)合功能的各種蛋白質(zhì)的純化。蛋白質(zhì)與染料的結(jié)合可能涉及疏水、靜電或氫鍵結(jié)合力等。

因此，盡管有市售的篩選各種染料的試劑盒，選擇純化給定蛋白質(zhì)的最佳染料也沒有現(xiàn)成的方法可楯。Scopes 按照與蛋白質(zhì)結(jié)合的能力將染料分類，并推薦了一個(gè)選擇最有效染料的系統(tǒng)。

染料配基層析的操作比較簡單?；谝恍┲С纸橘|(zhì)的染料層析柱填料可從市場獲得，這些推薦的商品都有很好的可再生性。在選擇適宜的染料配基時(shí)，非常實(shí)用的方法是連續(xù)進(jìn)行幾種染料配基層析試驗(yàn)，如果第一種不結(jié)合目的蛋白，也許第二種就會(huì)結(jié)合。洗脫時(shí)，絕大多數(shù)蛋白質(zhì)是采用高鹽方式洗脫，雖然后面還提及其他方法。染料配基柱若是與目的蛋白結(jié)合能力很有限，則可以降低溶液的pH值或應(yīng)用二價(jià)、三價(jià)陽離子時(shí)常會(huì)得到改善。總之，遵循上述這樣幾個(gè)辦法，染料配基層析將在蛋白質(zhì)純化中發(fā)揮重要作用。

實(shí)驗(yàn)材料

蛋白質(zhì)樣品液

試劑、試劑盒 Tris-HCl NaCl NaOH NaN3

儀器、耗材 層析柱

在開始染料配基層析純化蛋白質(zhì)之前，必須確定所用的染料。如前所述，需用不同染料柱進(jìn)行小規(guī)模（1 ml 柱）試驗(yàn)篩選。Scopes 推薦的策略可供參考。此外，進(jìn)一步的小規(guī)模試驗(yàn)可用于優(yōu)化洗脫參數(shù)。有必要提醒注意的是：一個(gè)能與許多蛋白質(zhì)結(jié)合而不結(jié)合目的蛋白的染料配基柱非常有用。它可以作為最終純化前去除雜蛋白的極佳步驟。以下介紹 Cibacron Blue F3GA 柱用高鹽溶液洗脫的方案。

1. 用5 ml Cibacron Blue F3GA-瓊脂糖裝填一個(gè)層析柱。對(duì)大多數(shù)實(shí)際應(yīng)用來講，短而粗的柱子應(yīng)能獲得滿意效果。長而細(xì)的柱子多用于純化結(jié)合力弱的蛋白質(zhì)，雖然流速會(huì)有所下降；

2. 10 倍柱床體積的層析緩沖液（例如，20 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，０.1 mol/L NaCl） 平衡裝好的柱子；

3. 為了達(dá)到上樣要求，蛋白質(zhì)樣品液需轉(zhuǎn)換成近似層析緩沖液的條件，即通過用層析緩沖液透析或 1：1 稀釋來進(jìn)行。上樣前樣品液應(yīng)經(jīng)離心或過濾達(dá)到澄淸。5 ml 柱子能上樣 50～200 mg 蛋白質(zhì)樣品。除非蛋白質(zhì)結(jié)合容量非常高，通常上樣蛋白質(zhì)濃度應(yīng)在 10～20 mg/ml 范圍；

4. 上樣到層析柱；

5. 5 倍柱床體積層析緩沖液洗柱或洗至 A280 值回到基線；

6. 5 倍柱床體積洗脫緩沖液（例如，20 mmol/L，pH 8.0 Tris-HCl，0.1 mol/L NaCl） 洗脫目的蛋白；

7. 檢測洗脫組分中的目的蛋白，并匯集含活性目的蛋白的組分；

8. 再生層析柱。先用 3 倍柱床體積 1 mmol/L NaOH洗柱，再用 10 倍體積含 0.02％ NaN3 的層析緩沖液洗柱即可。