WB 是實(shí)驗(yàn)室常見(jiàn)實(shí)驗(yàn)之一，蛋白定量后，上樣之前，還需要哪些步驟制樣呢？
1. 蛋白含量測(cè)定后，遠(yuǎn)慕建議大家把各個(gè)樣品稀釋到某一固定濃度（稀釋可使用 PBS，水或裂解液），等體積等質(zhì)量上樣，計(jì)算上樣體積時(shí)需包含 loading buffer 的體積。

例如：把所有蛋白濃度都稀釋到 2ug/ul，然后與 2Xloading buffer 1:1 混合后，濃度成為 1ug/ul，建議上樣 20-30ul 即可。

2. 與 loading buffer 混勻后，要將樣品在沸水中煮 3-5 分鐘，使蛋白充分變性。也可使用 PCR 儀 95°加熱 5 分鐘。

PS：煮沸并非必須步驟，有些蛋白僅需 70℃ 煮或無(wú)需煮沸，具體請(qǐng)參照抗體要求操作。

3. 煮沸后在冰上靜置少許時(shí)間后進(jìn)行低速離心，即可上樣。剩余樣品建議分裝后保存，樣品可以在 4℃ 冰箱短時(shí)間保存，也可以在-20 或-80℃ 保存，解凍后可重新煮沸上樣。

PS：樣品凍存時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或反復(fù)凍融會(huì)使蛋白質(zhì)的抗原特性改變，故推薦大家使用遠(yuǎn)慕生物超快速柱式法蛋白提取試劑盒，僅需幾分鐘就可完成總蛋白制備，再也不用擔(dān)心樣品質(zhì)量不好啦！

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳中樣品為什么要加 loading buffer？

loading buffer 的功能，第一，含有指示劑溴酚藍(lán)和二甲苯氰 FF 起到指示的作用，顯示電泳的進(jìn)程，以便我們適時(shí)終止電泳；第二，成分中的甘油可以加大樣品密度，使樣品密度大于 Tris   或者其他緩沖液，從而沉降到點(diǎn)樣孔中，防止樣品飄出點(diǎn)樣孔；第三，loading buffer 中 SDS 是比較強(qiáng)的陰離子表面活性劑，與蛋白質(zhì)表面結(jié)合，覆蓋蛋白質(zhì)本身的電荷性質(zhì)，使之表面帶負(fù)電荷。SDS 還可以破壞維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的重要因素--疏水鍵，使蛋白質(zhì)解構(gòu)。2-ME 和 DTT 是比較強(qiáng)的還原劑，可以打開(kāi)蛋白質(zhì)分子內(nèi)和分子間的二硫鍵, 使蛋白質(zhì)亞基分離。

上樣之前煮沸的目的是什么？

煮沸樣品的目的是為了更好地將蛋白質(zhì)的高級(jí)結(jié)構(gòu)打開(kāi)。在溫度高時(shí)，一方面維持蛋白質(zhì)高級(jí)結(jié)構(gòu)的各種作用力減弱，另一方面促進(jìn) SDS 的電荷覆蓋和疏水鍵打開(kāi)作用。通過(guò)上樣 buffer 和加熱的處理，蛋白樣品呈現(xiàn)帶負(fù)電荷的長(zhǎng)鏈（還原電泳），在電泳時(shí)的分子篩效應(yīng)使得泳動(dòng)只和蛋白質(zhì)大小有關(guān)（也就是表觀分子量），與蛋白形狀無(wú)關(guān)。