辛基-瓊脂糖凝膠H.P.生化試劑實(shí)驗(yàn)說明
2022-02-16 15:30 作者:洛辰 來源:上海遠(yuǎn)慕生物試劑
中文名稱:辛基-瓊脂糖凝膠H.P.
英文名稱:Octyl-Sepharose 4FF
凝膠類型:疏水層析填料
結(jié)構(gòu)成分:6%交聯(lián)瓊脂糖
粒徑:24-44μm
工作PH值:3-13
操作溫度:4-40℃
性狀:白色微球,凝膠狀,保存在20%酒精溶液中
用途:生化研究,疏水層析介質(zhì),高分辨率,適合生物大分子和疫苗的分離純化等。
保存條件:RT
操作溫度:室溫
儲存條件:4~28℃
使用方法:
1.裝柱
① 將所有的試劑和填料達(dá)到室溫.配制初始緩沖液(平衡液)和緩沖液。
② 根據(jù)柱子大小取所需凝膠的量,清洗掉20%乙醇,抽干,用初始緩沖液(按凝膠:緩沖液=3:1比例)配成勻漿。
③ 將柱內(nèi)及柱子底端用水或緩沖液潤濕并保持一小段液體(液面略高于濾膜),務(wù)必使底端無氣泡。
④ 用玻璃棒引導(dǎo)勻漿沿著柱內(nèi)壁一次性倒入柱內(nèi),注意不要使用氣泡。打開柱子出液口,使凝膠在柱內(nèi)自由沉降,連結(jié)好柱子頂端柱頭。
⑤ 打開蠕動泵,讓緩沖液用使用時(shí)流速的1.33倍的流速流過,使柱床穩(wěn)定。用2-3倍柱體積的緩沖液平衡柱子。
2.平衡
讓平衡緩沖液以一定流速流過柱子,到流出液電導(dǎo)和pH不變。平衡緩沖液一般是高鹽濃度的緩沖液,如:0.02~0.05mol/L的PBS加1~2.5mol/L(NH4)2SO4等。
3.上樣
① 樣品用平衡液配制,渾濁的樣品要離心、過濾后上柱;
② 一般情況是讓目標(biāo)產(chǎn)品結(jié)合在柱子上,用平衡洗液洗去雜質(zhì),再選擇一種洗脫液洗下目標(biāo)產(chǎn)品。
③ 介質(zhì)對樣品組分吸附的程度取決于樣品的疏水性質(zhì)、流動相的離子強(qiáng)度和溫度。溫度越大、鹽濃度越高或樣品組分疏水性越強(qiáng),介質(zhì)對組分吸附越牢。
4.洗脫
疏水介質(zhì)可用減小鹽濃度進(jìn)行洗脫。加表面活性劑或者有機(jī)溶劑可加強(qiáng)洗脫。最常用的洗脫液是低鹽濃度緩沖液,如:0.02~0.05mol/L的PBS。
5.再生
一般用低鹽濃度的緩沖液洗,洗10倍以上柱體積,接著用結(jié)合蛋白的平衡液洗到平衡,可再次使用。若有失活的蛋白或者脂類物質(zhì)在再生時(shí)洗不掉,可用在位清洗(CIP)除去。
6.在位清洗
① 對于以離子鍵結(jié)合上去的蛋白,可以用2M NaCl去除。
② 對沉淀蛋白、以疏水作用結(jié)合的蛋白或者脂類物質(zhì),可用1M NaOH去除。
③ 對強(qiáng)疏水性結(jié)合的蛋白、脂類等,可用4~10倍柱體積的70%乙醇或30%異丙醇清洗,但要注意有機(jī)溶劑的濃度以梯度的方式逐漸增加,否則容易產(chǎn)生氣泡。清洗完畢后,用至少3倍柱體積緩沖液平衡柱子。
7.去熱源
用0.5M的氫氧化鈉清洗柱子5~6小時(shí)或者用0.1M的氫氧化鈉24小時(shí)。或用以下步驟去除:
① 2倍柱體積的70%的乙醇;
(2)2倍柱體積50mM Tris-HCl pH7.5
③ 1倍柱體積4M尿素
④ 3倍柱體積的Tris緩沖液+0.1M NaCl;
以上緩沖液都在無熱源的雙蒸水中配制。
8.消毒
用0.5~1.0M NaOH室溫下洗8~10倍柱體積,初始緩沖液平衡柱子。
注意事項(xiàng):
1.密封貯存于4~28℃(保存溶液為20%乙醇+0.1M醋酸鈉),通風(fēng)、干燥的地方,不能冷凍。用過的柱子貯存于4℃(20%乙醇)。
2.在裝柱、使用和保存柱子的時(shí)候,要避免柱子流干,氣泡進(jìn)入。