1、核酸抽提原理

簡單地講，核酸抽提包含樣品的裂解和純化兩大步驟。裂解是使樣品中的核酸游離在裂解體系中的過程，純化則是使核酸與裂解體系中的其它成分，如蛋白質(zhì)、鹽及其它雜質(zhì)徹底分離的過程。 經(jīng)典的裂解液幾乎都含有去污劑 (如 SDS、Triton X-100、NP-40、Tween 20 等) 和鹽 (如Tris、EDTA、NaCl 等)。鹽的作用，除了提供一個合適的裂解環(huán)境 (如 Tris)，還包括抑制樣品中的核酸酶在裂解過程中對核酸的破壞(如 EDTA)、維持核酸結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定 (如 NaCl)等。去污劑則是通過使蛋白質(zhì)變性，破壞膜結(jié)構(gòu)及解開與核酸相連接的蛋白質(zhì)，從而實現(xiàn)核酸游離在裂解體系中。裂解體系中還可能加入蛋白酶；利用蛋白酶將蛋白質(zhì)消化成小的片段，促進核酸與蛋白質(zhì)的分開，同時，也便于后面的純化操作以及獲得更純的核酸。也有直接使用高濃度的蛋白質(zhì)變性劑 (如GIT、GuHCl 等) 裂解的，該方法已經(jīng)成為了 RNA 抽提的主流，卻不是基因組 DNA 抽提的主流。 zui常用的純化方法，一是PC 抽提 + 醇沉淀，二是介質(zhì)純化。*種方法是利用 PC對裂解體系進行反復(fù)抽提以去除蛋白質(zhì)，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)的分離；再用醇將核酸沉淀下來，實現(xiàn)核酸與鹽的分離。第二種方法則是利用某些固項介質(zhì)，在某些特定的條件下，選擇性地吸附核酸，而不吸附蛋白質(zhì)及鹽的特點，實現(xiàn)核酸與蛋白質(zhì)及鹽的分離。高鹽沉淀去除蛋白質(zhì)是*種純化方法的一個變體，省略了 PC操作的麻煩。當(dāng)然，也有不純化的抽提方法，但是用途多局限于簡單的 PCR。其它雜質(zhì) – 如多糖、多酚等 -的去除，基本上都是在這兩種方法的基礎(chǔ)上，通過增加一些特別的試劑，或者增加一些額外的步驟來實現(xiàn)的。
2、了解你的實驗樣品

如果你研究某個實驗樣品，并且要抽提它的核酸，以下的信息一定要先行收集：該樣品的核酸含量、酶含量、特殊雜質(zhì)含量。如果你對樣品的特點一無所知，當(dāng)樣品稍微有一點復(fù)雜時，抽提核酸的實驗就會碰到許多問題。以血液為例，如果你不知道鳥的血液中有核細胞的含量是人血的千倍左右，而使用人血一樣的起始量去抽提鳥血的基因組 DNA，怎么可能成功？失敗了又怎么知道原因所在？同時，只有對實驗樣品有所了解，才能正確選擇裂解方法。 絕大部分情況下，使用新鮮樣品可以獲得zui好的結(jié)果。對一些雜質(zhì)含量高的樣品，如果使用新鮮樣品抽提基因組 DNA 是碰到雜質(zhì)殘留過大的問題，可以試一下 -20C保存一天后再抽提的對策，可能會有意想不到的效果。樣品如果因為某些原因必須先行保存，也要先簡化一下樣品：血液zui好只保存有核細胞；將樣品分割后保存，避免反復(fù)凍融。如果實驗室不具備合適的保存條件，將樣品先裂解后再保存，是一個不錯的選擇。

3、裂解方法的評價

含蛋白酶的裂解方法，可以認為是抽提基因組 DNA 的首選。裂解包括膜蛋白的游離和與基因組 DNA相連接的蛋白質(zhì)的游離。蛋白酶的作用是使蛋白質(zhì)變小，故而對蛋白質(zhì)的游離有巨大的促進作用；同時，巨大的基因組 DNA是很容易"纏"住大分子的東西的，蛋白質(zhì)被蛋白酶消化變小后，則不容易被基因組 DNA"纏"住，有利于蛋白質(zhì)在純化操作中的去除，使zui終獲得的基因組 DNA 的純度更高。另外一個思路是，如果基因組 DNA 與蛋白質(zhì)"纏"在一起，在純化的過程中有兩種可能：如果基因組 DNA 的特性占優(yōu)勢，則純化時以 DNA的形式被保留下來，導(dǎo)致蛋白質(zhì)的殘留；如果蛋白質(zhì)的特性占優(yōu)勢，則純化時以蛋白質(zhì)的形式被去除，導(dǎo)致 DNA 的損失。有些樣品，如肌肉，即使是RNA 抽提，也強烈建議使用含蛋白酶的裂解液 (或者在操作中的某個時候使用蛋白酶消化蛋白質(zhì))，原因在于這些樣品中的蛋白質(zhì)，是非常難以去除的。該方法是獲得zui大得率和zui高純度的基礎(chǔ)。 不使用蛋白酶的去污劑裂解方法，仍然在細胞基因組 DNA抽提方面有優(yōu)勢，尤其是當(dāng)?shù)寐屎图兌纫蟛皇莦ui高，而經(jīng)濟性及操作簡單很重要時?？刂坪昧呀庖?樣品的比例是該方法成功的關(guān)鍵。該方法結(jié)合高鹽沉淀，可以實現(xiàn)zui簡單的操作，但純度及得率的穩(wěn)定性可能會比用 PC 抽提的差一些。 高濃度蛋白質(zhì)變性劑 (如 GIT、GuHCl 等)的裂解方法，是抽提 RNA 的首選?？?RNA 的抽提，zui重要的是快速裂解細胞膜，至于與基因組 DNA 相連接的蛋白質(zhì)的裂解以及基因組與蛋白質(zhì)"纏"住的問題，因為都不會對以后的純化產(chǎn)生大的影響，可以不考慮。高濃度蛋白質(zhì)變性劑能快速破壞細胞膜，進而迅速抑制住細胞內(nèi)的 RNA酶，從而確保了 RNA 的完整性。除了極少量不適用該方法的樣品 – 主要是植物，其它絕大部分樣品的 RNA的抽提，都可以以高濃度的蛋白質(zhì)變性劑為基礎(chǔ)的。該方法也可用于基因組 DNA 抽提，非常快速簡單，但純度不是很高。 含 CTAB的裂解液，幾乎成為富含多糖的樣品，如細菌、植物的基因組 DNA 抽提的首選裂解方法。

該方法成功與否與兩個因素有關(guān)：一是 CTAB的質(zhì)量，二是洗滌的徹底程度。CTAB 的質(zhì)量對裂解效率有很大的影響，而且，似乎還說不清楚原因，因為即使是同一公司生產(chǎn)的純度一樣的CTAB，批號不同，效果就可能差別很大。洗滌去除 CTAB 要比其它的鹽難一些，同時， CTAB的少量殘留也會對酶活性有巨大影響，所以洗滌是否徹底也是該方法成功與否的關(guān)鍵。裂解時的溫度，多使用65C；但如果發(fā)現(xiàn)降解嚴重或者得率太低，可以試一下 37C – 45C 這個相對低溫的區(qū)域。 SDS堿裂解法是質(zhì)粒抽提的首選裂解方法，具有快速、得率高、幾乎無基因組 DNA污染的特點?？刂坪昧呀庖?菌體的比例和操作的溫和是該方法成功的關(guān)鍵。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C 會更好一些，所以，加入溶液 III 后在 4C靜置一段時間以及采用 4C 離心去蛋白質(zhì)，都可以提高質(zhì)量。該方法不一定要使用 PC 純化，但結(jié)合 PC 純化，可以獲得純度很高的質(zhì)粒。RNA的去除可以靠在溶液 I 中加入 RNase A (100ug/ml) 或者在zui后的溶解液中加入 RNase A (25 ug/ml)來實現(xiàn)。總的感覺是，在溶液 I 中使用 RNase A，RNA 的殘留少一些。不過，經(jīng)典沉淀幾乎沒有辦法徹底去除 RNA 殘留。另外，對大質(zhì)粒(50 kb 以上)，該方法可能會有問題。

PCR模板的簡易裂解方法，也是使用面很廣的一類方法。該方法的特點是無須純化，樣品被裂解后即可直接取裂解液用于PCR，非?？焖佟Ｒ舱驗椴患兓?，所以，假陰性 (即沒有擴增出來的陽性)比例也比較高。該方法zui簡單的裂解液就是水，復(fù)雜一點的就會含有一些不會抑制后續(xù)的 PCR 反應(yīng)，而且能提高裂解效率，甚至還可能部分消除樣品內(nèi)抑制PCR 反應(yīng)雜質(zhì)的東西，如 Triton X-100、甲酰胺等。再復(fù)雜一點的就會含有諸如 Chelex 100之類的能吸附部分雜質(zhì)的介質(zhì)。操作也非常簡單，多使用溫度的變化來實現(xiàn)樣品的裂解，如煮沸、或者高溫-低溫的多次循環(huán)等。該方法zui適合從一大堆樣品中找出陽性樣品，但卻不適合用于判斷某一個樣品是陽性還是陰性。降低樣品使用量可以提高陽性率，因為樣品量的降低，同時意味著 PCR 的抑制物量的降低。 選擇了合適的裂解液，下一步就是要控制好樣品與裂解液的比例。這個問題非常重要，但卻沒有獲得足夠的重視。嚴肅的參考資料，都應(yīng)該會提供一個簡單的比例，如1ml 裂解液可以用于 T mg 組織或者 C個細胞；我的建議是，你的樣品量絕對要小于資料所提供的。起始樣品用多大，并沒有具體的說法。如果不是樣品量有限，則以能抽提出滿足數(shù)次成功實驗所需的核酸量，作為決定樣品起始量的基礎(chǔ)，會比較合理的。不要因為 1ml 裂解液可以抽提 100mg 樣品，就一定使用 100mg樣品。裂解液的用量，表面上與抽提的結(jié)果 (純度及得率)沒有關(guān)系，然而，在實際操作中，對結(jié)果是有比較大的影響的。裂解液的用量原則是：確保能徹底裂解樣品，同時使裂解體系中核酸的濃度適中。濃度過低，將導(dǎo)致沉淀效率低，影響得率；濃度過高，去除雜質(zhì)的過程復(fù)雜且不徹底，導(dǎo)致純度下降。另外，裂解液的用量是以樣品中蛋白質(zhì)的含量為基準(zhǔn)的，而不是以核酸含量為基準(zhǔn)，這一點務(wù)必牢記。

4、純化方法

評價 PC 抽提/醇沉淀方法，是一個永不過時的方法。穩(wěn)定、可靠、經(jīng)濟、方便。PC抽提可以徹底去除蛋白質(zhì)，醇沉淀可以去除鹽，對于一般的干凈的樣品 (雜質(zhì)為蛋白質(zhì))，該方法完全可以獲得高質(zhì)量的核酸。雖然每次 PC抽提都會損失一部分核酸(因為不可能將水相全部移取)，以及低濃度核酸的醇沉淀效率低，但這些問題都可以靠操作的調(diào)整而得以解決或者減少影響。該方法的zui大的問題是不適合大規(guī)模抽提。 PC抽提是去除蛋白質(zhì)的一個非常有效的手段。苯酚能使蛋白質(zhì)變性，變性后的蛋白質(zhì)從水相中被析出，處于苯酚中或者苯酚/水相之間。PC抽提的關(guān)鍵是，一要混勻徹底，二要用量足夠。徹底混勻，才能確保苯酚與蛋白質(zhì)的充分接觸，使蛋白質(zhì)完全變性。許多人總是擔(dān)心混勻的劇烈程度是否會對核酸，尤其是基因組 DNA 造成破壞，實際上大可不必如此小心。劇烈的混勻操作，是會部分打斷大分子的基因組 DNA，但該破壞作用不會強烈到 DNA變成 10kb 以內(nèi)的小片段。手劇烈晃動混勻后，基因組 DNA 的片段，大部分會大于 20kb，這個大小，除了一些特別的要求外，對 PCR和酶切，都是完全適用的。如果要求的片段非常大，如構(gòu)建文庫用，則不能使用劇烈的混勻方法，而只能來回溫和顛倒混勻 –此時的關(guān)鍵是：裂解液的比例要足夠大，使體系不要太粘稠。用量要足夠，是因為苯酚去除蛋白質(zhì)是有一定的飽和度的。超過了該飽和度，裂解體系中的蛋白質(zhì)不會被一次去除，必須靠多次抽提，方可徹底去除。另外，體系太粘稠的壞處是，蛋白質(zhì)難以徹底去除，以及基因組 DNA會斷裂得更厲害，所以要注意裂解液與樣品的比例。4C 離心操作有利于更徹底去除蛋白質(zhì)。PC 抽提的另外一個用途是，利用酸性酚可以部分去除 DNA的特點，在 RNA 抽提時獲得 DNA 殘留極少的 RNA。不過有一點要提醒的是，有些植物樣品，在去除某些雜質(zhì)之前，是不能使用 PC抽提的，否則核酸必定降解。 高鹽沉淀蛋白質(zhì)/醇沉淀方法，同樣也是一個非常不錯的方法。與 PC抽提方法相比，除了純度的穩(wěn)定性可能要低一點外，該方法幾乎克服了 PC抽提的所有缺點。更快、更輕松去除蛋白質(zhì)所伴隨的好處是，可以用于大規(guī)模抽提，不足是純度 (蛋白質(zhì)殘留) 不夠穩(wěn)定。蛋白質(zhì)的沉淀效率在 4C會更好一些。 介質(zhì)純化方法，是一個越來越受到重視的方法。其zui大特點是非常適合大規(guī)模核酸抽提，并且因為受人為操作因素影響小，純度的穩(wěn)定性很高 (雖然純度不一定比PC純化方法更高)。其致命弱點是樣品過量。介質(zhì)可以分為兩大類，一類是柱式的，即介質(zhì)被預(yù)先裝填在下面是通的柱子里；另外一類則是顆粒狀(如Glassmilk、磁性小珠等)。顆粒狀的介質(zhì)的純化操作與經(jīng)典的醇沉淀差別不大，都是通過數(shù)次的加液-倒液過程，干燥后，溶解即可獲得純化好的核酸。柱式純化的操作雖然也是有加液-倒液過程，但因為加入的液體通過離心后會進入另外一個離心管中，與含有核酸的柱子完全是分開的，所以洗滌更徹底，操作更省力 (不用操心將核酸倒掉了，或者液體的殘留)。不過，介質(zhì)純化方法的成本是zui高的。

5、醇的沉淀

醇的沉淀，目的是使核酸從裂解體系中沉淀下來，從而實現(xiàn)核酸與其它雜質(zhì) – 主要是鹽 –的分離。實際操作中，許多雜質(zhì)也會與核酸一起被醇沉淀下來，尤其是當(dāng)其它雜質(zhì)的濃度也比較高的時候。醇的沉淀并不是非常特異性的，任何有機大分子及一些鹽，當(dāng)濃度達到一定水平后，都可能同步被沉淀下來。 就核酸而言，標(biāo)準(zhǔn)的醇沉淀要求有一定的鹽及某一比例的醇用量，但這決不是說這些鹽是必不可少的或者醇的比例是不可更改的。實際操作中不難發(fā)現(xiàn)，當(dāng)裂解體系中核酸的濃度達到一定水平后，即使體系中不含教科書中建議的鹽，單獨使用醇也可以使核酸沉淀下來；或者含有鹽，使用低比例的醇也可以使核酸沉淀下來(當(dāng)然，得率可能會降低)。知道這一點的意義在于：不要迷信標(biāo)準(zhǔn)方法的*性；相反，當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)方法碰到問題 – 主要是純度問題 –時，完全可以通過調(diào)整沉淀條件來改善。zui有參考價值的是 TRIzol提供的一個沉淀方案：一半異丙醇加一半高鹽溶液替代純粹的異丙醇，可以大大降低多糖殘留。另外一個問題就是，要堅信核酸的醇沉淀過程同樣也是其它雜質(zhì)的沉淀過程；調(diào)整醇沉淀的條件，雖然會降低核酸的得率，但因為可以大大提高純度。 如果核酸抽提的起始樣品是比較"臟"的，原則上不要使用低溫沉淀。低溫沉淀能提高沉淀效率：當(dāng)核酸濃度很低時，效果明顯；當(dāng)核酸濃度比較高時，效果不明顯，但卻會導(dǎo)致雜質(zhì)的大大增加。 醇沉淀使用異丙醇還是乙醇，我沒有發(fā)現(xiàn)這二者對質(zhì)量有大的影響，雖然許多人"發(fā)現(xiàn)"乙醇沉淀的核酸純度更高。異丙醇沉淀的核酸比較緊湊，帖壁緊，顏色不是很白；乙醇沉淀的核酸比較蓬松，容易從壁上移動，顏色比較白。這是現(xiàn)象，提示結(jié)論：異丙醇沉淀的核酸不容易丟掉，但比較難洗滌。結(jié)合丟失和洗滌兩個方面綜合考慮，則建議：少量核酸用異丙醇沉淀 (量少，洗滌不是問題，不丟失為先)，大量核酸用乙醇沉淀(量大，丟失不是問題，洗滌方便為先)。至于異丙醇沉淀更容易沉淀下鹽的說法，我沒有碰到過(我?guī)缀醪皇褂玫蜏爻恋恚y道低溫沉淀比較容易出現(xiàn)鹽沉淀？)；我更覺得出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因就在洗滌的不徹底。 當(dāng)然，也不要忘記異丙醇沉淀的zui大優(yōu)點是體積小，可以使絕大部分的小量抽提操作在 1.5ml離心管內(nèi)完成。但由于其沉淀物很緊湊，洗滌時其中心部分不容易被洗滌到，所以，洗滌異丙醇沉淀的核酸的關(guān)鍵是：一定要使沉淀懸浮起來，一定要放置一段時間使沉淀zui終變成蓬松的白色。如果再洗滌一次，質(zhì)量決不會有問題的。 PEG、LiCl、CTAB 都可以用于核酸沉淀。雖然它們遠沒有醇沉淀的高使用頻率，但卻各有特點。LiCl 可以沉淀 RNA 以去除 DNA，CTAB 可以從含多糖的裂解體系中將核酸沉淀下來。PEG 是沉淀病毒顆粒的方便手段。

6、洗滌

洗滌首先一定要將沉淀懸浮起來；第二就是要有一定的時間，尤其是當(dāng)核酸沉淀比較大時(使核酸沉淀zui終蓬松)；第三是少量多次；第四則是去上清要徹底。教科書中的操作基本上都是"倒掉上清后倒置在吸水紙上片刻"，這一描述本身沒有問題，且十分方便，但因為他來自國外，自然就有了"水土不服"的問題。如果離心管是經(jīng)過硅化的，因為液體幾乎不掛壁，所以上清可以去除得非常徹底；好的管子，即使沒有經(jīng)過硅化，殘留量也非常少，也沒有什么問題；差的管子，液體的掛壁非?？捎^，其殘留量多到會影響后續(xù)的實驗。*不受管子質(zhì)量影響的操作，就是倒掉液體后再短暫離心，將殘液用移液器吸出。一定要牢記的是，殘液中都含有上一步操作中的雜質(zhì)，其殘留量與混勻程度、核酸沉淀的大小都有關(guān)。揮發(fā)時去掉的是乙醇，雜質(zhì)是不會被揮發(fā)去除的。 另外，核酸沉淀的大小及裂解液的裂解能力也決定了洗滌的強度。沉淀越大，裂解液的裂解能力越強，洗滌越要徹底：放置時間相對要長一點，洗滌次數(shù)也要考慮增加。zui關(guān)鍵的，洗滌一定要用室溫的 75% 乙醇。

7、核酸的溶解和保存

純化后的核酸，zui后多使用水或者低濃度緩沖液溶解；其中 RNA 以水為主，DNA 則多以弱堿性的 Tris 或者 TE 溶解。經(jīng)典的 DNA溶解方法多提倡使用 TE 溶解，認為 EDTA 可以減少 DNA 被可能殘留下來的 DNase 降解的風(fēng)險；如果操作過程控制得當(dāng)，DNase的殘留幾乎是可以忽略的，完全可以直接使用 Tris 或者水 (pH 接近 7) 溶解 DNA。 基本上，核酸在保存中的穩(wěn)定性，與溫度成反比，與濃度成正比。雖然也有部分實驗人員發(fā)現(xiàn)，-20C 保存的 DNA 比 -70C 保存的穩(wěn)定，我卻寧可認為這是個例。 如果溫度合適，保存中核酸發(fā)生降解或者消失，首要原因是酶殘留導(dǎo)致的酶解，第二個原因則是保存核酸溶液的 pH 值不合適

導(dǎo)致的水解 (RNA在弱酸性更穩(wěn)定，而 DNA 在弱堿性更合適)。還有一個不為人重視的，就是 EP管對核酸的影響。首先一定要堅信一點，那就是核酸一定會與裝它的容器的接觸面發(fā)生反應(yīng)，達到某種均衡。EP管的材質(zhì)，首先可能吸附核酸，其次還可以誘導(dǎo)核酸的結(jié)構(gòu)發(fā)生某些變化，如變性。在核酸的濃度比較高時，這個現(xiàn)象可能觀察不到；當(dāng)核酸濃度很低時，則比較明顯了。在低濃度的核酸中加入 Geletin,Glycogen,BSA 可以穩(wěn)定核酸，雖然已經(jīng)為實驗所證明，但許多實驗人員并沒有將該建議當(dāng)回事。 現(xiàn)在制造 EP 管的材料遠多于過去。這些新出現(xiàn)的材料，在強度、透明度等物理特征方面可能比原來的純 PP材質(zhì)要好許多，但其化學(xué)特征，尤其是對核酸穩(wěn)定性的可能影響，遠沒有研究透徹。正如現(xiàn)在的質(zhì)?？梢愿脑斓迷絹碓竭m用某些要求一樣，其負面產(chǎn)物可能是，抽提的質(zhì)粒電泳的構(gòu)型越來越多：除了原來的三種帶型外，還可能出現(xiàn) denatured cc 、multimeric forms of cc 等等帶型。

8、核酸質(zhì)量的檢測問題

將抽提好的核酸直接用于后續(xù)的實驗，是*可靠的檢測方法；除此之外的檢測方法，都是相對的，而且并不十分可信。目前用于正式實驗前檢測核酸質(zhì)量的方法，一是電泳，二是紫外分光光度儀。電泳檢測的主要是核酸的完整性和大小，只要核酸不是太小或者太大(超出電泳分離范圍)，該方法還是非?？尚诺?；電泳還可以用于估計核酸的濃度，但其準(zhǔn)確度與經(jīng)驗有關(guān)；另外，電泳也可能提供某些雜質(zhì)污染的信息，但是同樣與經(jīng)驗有關(guān)。紫外分光光度儀檢測的是純度和核酸含量，然而，由于紫外分光光度儀不能確保非常準(zhǔn)確，而該儀器的靈敏度又非常高，所以，提供的結(jié)果并不十分可信。一般講，同時進行紫外和電泳檢測，綜合二者的結(jié)果，可以做出一個更合理的判斷。但由于這兩個方法都有缺陷，所以，即使出現(xiàn)壞的結(jié)果能用于后續(xù)實驗而好的結(jié)果卻不能用于后續(xù)實驗，也不用大驚小怪。 關(guān)于紫外分光光度儀的檢測。首先，不要使用不能選擇波長的儀器；使用那些已經(jīng)固定了波長的儀器，大概可以算是你夢魘的開始。(沒有信息是可怕的，更可怕的是將錯誤的信息當(dāng)真。)其次，一定要經(jīng)常調(diào)較儀器；調(diào)較可以使用非常純的自備核酸，也可以使用苯酚 (后者是我目前每次都使用的方法，非常簡單；具體道理可以見我以前的帖。)zui后，要記住讀數(shù) A230 : A260 : A280 = 1 : 2 (DNA 為 1.8) : 1為理論上的數(shù)據(jù)，實際測定時會有一些差別；但如果差別太大，就有問題了。有兩個值得商榷的觀點：如果 A260/A230 > 2就是純的，如果 A260/A280 > 2.3 就是核酸降解。A260/A230 如果比 2.0 大許多，一定是有雜質(zhì)殘留的(具體是什么雜質(zhì)我不知道)。如果核酸抽提好后立即就測定，A260/A280 > 2.3 決不提示核酸降解，原因是：那些能導(dǎo)致A260/A280 > 2.3 的核酸片段非常小，常規(guī)的沉淀是不可能將它們沉淀下來的；更可能的原因是：你儀器提供的 A260/A280實際是 A262/A282 甚至 A264/A284 的值。純的核酸的吸光值，在 A230 是谷底，在 A260 是峰頂，在 A280則正好是半山坡。根據(jù)曲線在底和頂?shù)男甭蕑ui小，在半山坡的斜率zui大的特點，不難得出如下結(jié)論：A230 和 A260的讀數(shù)受儀器準(zhǔn)確性的影響比較小，而 A280 受儀器準(zhǔn)確性的影響比較大。 建議先電泳檢測，再用紫外分光光度儀檢測。電泳后，可以看到哪些樣品根本就不能用 (如降解太厲害)，以及核酸的大致濃度，這樣就為紫外分光光度儀的檢測提供了一個參考 (降解的不必要測了，要測的該取多少量等)。

9、問題解答

A 抽提過程中的現(xiàn)象及可能的原因 I：核酸不溶解或者難溶解 – 蛋白質(zhì)殘留 (雖然目前更多的資料強調(diào)的是過分干燥所致。)。75%乙醇洗滌后，如果是空氣干燥，幾乎不可能過分干燥的，尤其是在南方潮濕的地方。佐證實驗：撕取少量 Merck 的絲狀CT DNA到一個離心管中，加入無水乙醇；10 分鐘后徹底去除乙醇；待乙醇完全揮發(fā)后，加入 TE，10 分鐘后溶液就非常均勻而粘稠了。 II：使用異丙醇沉淀核酸，沉淀為白色 – 多糖殘留。 III：核酸溶解后為乳白色 – 多糖殘留。 IV：75% 乙醇洗滌異丙醇沉淀的核酸時，沉淀變大了 – 見 10-III。

B 紫外檢測 I：A260/A280 比值低 – 蛋白質(zhì)殘留。但如果操作過程中使用了苯酚，則更可能是苯酚殘留。 II：A260 值提示的含量與電泳檢測時提示的含量有可見的誤差 – 苯酚殘留。

C 電泳中的現(xiàn)象及可能的原因 I：加樣孔有熒光 – 首先一定有 DNA 的滯留；其次多含蛋白質(zhì)殘留；如果是比較特殊的樣品，其雜質(zhì)也可能導(dǎo)致熒光。蛋白質(zhì)幾乎不會被 EB染色，能出現(xiàn)熒光，則一定含有核酸。非常巨大的基因組DNA (>50kb)，如果使用普通的瓊脂糖電泳，往往不能電泳出孔，單獨就可能滯留在加樣孔中產(chǎn)生熒光。更多的時候，是比較大的 DNA與殘留的蛋白質(zhì)結(jié)合后，電泳不能出孔而在孔中產(chǎn)生熒光。酶反應(yīng)產(chǎn)物，如果沒有經(jīng)過純化去除酶，也非常容易在孔中出現(xiàn)熒光，其原因是酶與核酸幾乎都有比較強的結(jié)合能力 (基因組 DNA 的PCR產(chǎn)物電泳往往在孔中都有熒光，而且熒光強度與體系的特異性成反比。)。如果是植物樣品，還可能由其它雜質(zhì)殘留引起。我的經(jīng)驗是：蛋白殘留的熒光有點發(fā)悶，其它雜質(zhì)殘留亮得很刺眼，且薄得銳利。 II：總 RNA 非變性電泳顯示過多的條帶 – 根本就不是問題。 III：總 RNA 非變性電泳顯示 28S 不如 18S 亮，但條帶清晰無彌散 – 多提示 28S 沒有被 EB 飽和。RNA 殘留多時，基因組 DNA 的電泳也會有相似現(xiàn)象。簡單的補染可以解決此問題。再次電泳時，或者降低上樣量，或者增加膠中 EB 的量。

D 降解的現(xiàn)象、原因及對策 降解的現(xiàn)象，如果拋開問題電泳所致，可以簡單總結(jié)如下：主帶不再突出，向小片段方向發(fā)生彌散，亮度比較均衡地衰減。如果同時還伴隨下列的一個或者多個現(xiàn)象，則需要更進一步的檢測：加樣孔非常的亮、彌散發(fā)生在主條帶位置的上下兩個方向、從加樣孔即開始發(fā)生彌散。 以現(xiàn)在的裂解液的裂解能力而言，降解的發(fā)生主要是在徹底勻漿之前，只有極少量由不干凈的溶解液導(dǎo)致。以總 RNA 抽提為例，本站就有帖總結(jié)為：總RNA 的質(zhì)量由高到低依次為懸浮細胞、貼壁細胞、組織(此處的質(zhì)量不僅指純度，也指完整性才對)。徹底裂解懸浮細胞的時間zui短，徹底裂解組織的時間zui長，這就是降解多發(fā)生在徹底勻漿之前的一個佐證。再看一看新鮮樣品和冷凍保存樣品，非常嚴格的冷凍保存和勻漿操作的確可以確保冷凍樣品的核酸的質(zhì)量；但是，有許多實驗室并不具備嚴格的保存手段，實驗人員的操作也并非完美，其結(jié)果就是核酸的降解。RNA 抽提受的影響因素太多，就以基因組 DNA 的抽提為例看一看吧。假定消化使用的是含蛋白酶 K的溶液，無論你使用的是新鮮樣品還是冷凍保存樣品，如果混勻徹底，可以預(yù)期的降解為：細胞 – 不應(yīng)該降解，碾碎的組織 – 不應(yīng)該降解，大塊組織(包括鼠尾) –部分降解。如果電泳發(fā)現(xiàn)新鮮的細胞和碾碎的新鮮組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象是假象；如果電泳發(fā)現(xiàn)冷凍的細胞和碾碎的冷凍組織發(fā)生了降解現(xiàn)象，該現(xiàn)象不是假象，就是樣品在保存中已經(jīng)降解了。說得更極端一點，即使蛋白酶 K 失活了，消化試劑的裂解能力也足以保證細胞的基因組 DNA在抽提過程中間不被降解。 減少或者杜絕核酸降解，一定要將重點放在樣品被徹底勻漿之前。樣品的保存在前面已經(jīng)說過了，不重復(fù)。其次就是要縮短樣品從脫離原來的生存環(huán)境或者低溫到被徹底勻漿之間的時間。

E 后續(xù)酶反應(yīng)失敗 資料書中連篇累牘的原因我就不說了，因為都對。我相信因為大家首先相信的就是它們，所以碰到問題首先一定會從那些方面著手。如果三次實驗后，問題還沒有解決，那么 90%的可能在于洗滌方式的不嚴格導(dǎo)致的小分子物的殘留。小分子物像刀，可以陸續(xù)"殺"死很多酶；大分子物如蛋白質(zhì)，像繩子，只能"捆住"一個目的核酸或者酶。更嚴格的洗滌可以解決該問題。

F 蛋白質(zhì)是如何殘留的 PC 純化：a-取上清時取到中間層及下層；b- PC 用量不足；c-混勻不徹底；d-溶解于上清中的少量 PC 中含有的蛋白質(zhì)。 高鹽沉淀：a-取上清時取到了蛋白沉淀；b-裂解不徹底；c-裂解液用量不足，使裂解體系太粘稠；d-溶解度問題 (可以使用低溫沉淀加以改善)。 介質(zhì)：a-裂解不徹底；b-裂解體系太粘稠。

G 小分子物質(zhì) (苯酚、鹽) 是如何殘留的 醇沉淀：洗滌不徹底。其原因與管子、操作手法等有關(guān)。 介質(zhì)：顆粒狀介質(zhì)的原因與醇沉淀相同。柱式的幾乎都是柱子設(shè)計上的缺陷所致，極少數(shù)由操作者未嚴格按要求操作所致。

10、某些使用的操作手法

實驗做多了，的確希望能偷點懶；偷懶也有講究，否則就是偷雞不成失把米。下面就是一些在確保抽提成功前提下的通用操作方法；有些看起來很麻煩，但請想一想抽提失敗后的再次抽提，應(yīng)該是可以算偷懶的方法了： I：混勻操作 (1.5ml 離心管內(nèi)) – 如果液體體積在 100ul 以內(nèi)，用指頭彈擊尖底混勻；在100-400ul 之間，用振蕩器混勻；大于400ul，用手晃動混勻：晃動時使離心管底永遠處于斜上位置，頻率要快。 II：PC 抽提時上清的移取 – 離心管傾斜，根據(jù)上清的量選擇不超過 200ul 的移液器，在外面先壓下移液器，再將 tip 移入上清。Tip 要盡可能靠近液面，tip 的尖嘴接觸內(nèi)壁，緩緩松手吸取上清?？啥啻我迫?，但決不要使用 1ml 移液器。 III：核酸的洗滌 – 核酸沉淀后離心，將上清倒掉。如果核酸是來源于雜質(zhì)比較多的樣品 (如植物、動物肝臟、細菌等)，則在加入 75%乙醇之前，再將離心管短暫離心后，用移液器將殘留液體徹底吸出，否則，75% 的乙醇非常容易將殘留液體中的多糖等雜質(zhì)給沉淀下來。移取 75%乙醇使用一次性的塑料吸管，加入后將核酸徹底懸浮起來，置于室溫一段時間 (時間長短取決于沉淀大小)，期間多混勻幾次。如果去除 75%乙醇的操作是"離心后倒掉再短暫離心后吸出殘留液體"，則洗滌 2 次；如果去除 75% 乙醇的操作是"離心后倒掉"，則洗滌 3次，但zui后一次仍然采用"離心后倒掉再短暫離心后吸出殘留液體"。這樣洗滌的目的，是確保小分子物的殘留低于 10 萬分之一 (zui大殘留不高于10uM 級)。

11、一些特別的問題

a：EP 管的問題 幾乎沒有人會認為 EP 管的質(zhì)量會與核酸抽提的操作有關(guān)，與某些現(xiàn)象 (如核酸在 -20C 保存一天后發(fā)生了降解) 有關(guān)系，但事實是，EP 管的質(zhì)量的確與核酸抽提的質(zhì)量以及核酸保存時的穩(wěn)定性有關(guān)。 硅化可以提供zui高質(zhì)量的 EP 管，使某些奇怪的現(xiàn)象消失或者大大減輕。zui糟糕的 EP 管對液體有較強的吸附力，在傾倒液體時殘留多，核酸在管中保存的過程中會發(fā)生變性。這樣的管子是很有市場的，因為便宜；而正因為便宜，其材料總是不令人放心的。 我個人認為，只有硅化過的 EP 管，才可能按照標(biāo)準(zhǔn)操作獲得滿意的結(jié)果。否則，某些操作步驟必須調(diào)整，才可以獲得穩(wěn)定的質(zhì)量。

b：核酸抽提中的溫度問題 核酸抽提中的溫度問題，也是一個值得關(guān)注的問題。首先要明確的一點是，任何一個溫度條件，對某些方面有利，同時也一定會有不利的一面。如沉淀，低溫操作會提高得率，但也會增加雜質(zhì)的殘留。任何一步操作該用什么溫度為好，應(yīng)該是利弊權(quán)衡的結(jié)果?；旧?，除了一些特殊的步驟，如消化等外，用室溫是zui好的選擇。那些認為"低溫操作可以防止或者減少降解"之類的理由，并沒有多少可操作性的。低溫的確可以減低酶的活性，但低溫同時也降低了這些酶被裂解液中的試劑滅活或者抑制的速度，此消彼長，沒有辦法給出結(jié)論的。就 RNA 抽提而言，徹底勻漿前在冰上操作可以降低 RNA 被降低的風(fēng)險，徹底勻漿后的溫度對RNA 的完整性影響已經(jīng)不會大的；如果發(fā)現(xiàn)影響很大，說明 RNase沒有被裂解液有效抑制，提示裂解液的用量不足。更沒有道理的是認為低溫沉淀和低溫洗滌可以防止降解了。事實上，核酸一旦被沉淀下來，對酶的耐受力是很強的，這就是核酸保存在醇溶液中zui穩(wěn)定的理論基礎(chǔ)。如果說沉淀使用低溫還可以提高得率，洗滌使用低溫又是為什么？徹底的錯誤而已。

c：如何閱讀操作手冊 拿到操作手冊后，要倒著閱讀：先閱讀問題解答，再看操作步驟下面的說明，再看操作步驟。問題解答是別人在使用過程中曾經(jīng)碰到過的問題集錦，操作步驟下面的說明是商家的警告。沒有一個商家會將他的操作步驟寫得非常復(fù)雜，因為這是滿足使用人員習(xí)慣的結(jié)果。一句話，PS 和 By the Way之類的話中含有真正的有用素材。