一、糖類代謝試驗(yàn)

1.1 糖（醇）類發(fā)酵試驗(yàn)

不同細(xì)菌含有發(fā)酵不同糖（醇）的酶，因而發(fā)酵糖（醇）的能力各不相同。即使某些能發(fā)酵同樣的糖（醇），但其產(chǎn)物也不同，有的產(chǎn)酸產(chǎn)氣，有的產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，可根據(jù)這些特點(diǎn)來(lái)鑒別細(xì)菌。

大致可分為：

液體發(fā)酵管：無(wú)糖肉湯或蛋白胨水中，加入1%糖（醇）類指示劑，一支小玻管，經(jīng)滅菌后備用。若被檢細(xì)菌對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求較高時(shí)，則在試驗(yàn)前加入2%~5%無(wú)菌血清。

半固體發(fā)酵管：在液體糖（醇）發(fā)酵培養(yǎng)基中，加入0.3%~0.5%瓊脂，溶化后分裝試管，滅菌后讓試管直立，使瓊脂凝固，做成高層培養(yǎng)基，接種細(xì)菌應(yīng)用接種針穿刺接種。

固體發(fā)酵管：此類培養(yǎng)基一般不常用，僅用于營(yíng)養(yǎng)要求較高的某些細(xì)菌，在含糖類及5%~10%血清瓊脂斜面上進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)。另外固體高層糖發(fā)酵管，可用于厭氧細(xì)菌糖發(fā)酵試驗(yàn)，如產(chǎn)氣莢膜桿菌在含糖的固體高層發(fā)酵管中出現(xiàn)洶涌發(fā)酵（產(chǎn)生大量氣體）。

雙糖（或三糖）高層斜面發(fā)酵管：這種培養(yǎng)基含有葡萄糖和乳糖（或再加蔗糖），這兩種糖（或三種糖）混在一起，制成高層斜面，其中葡萄糖和乳糖（或蔗糖）比例為1:10。

各種糖（醇）發(fā)酵管含糖（醇）的濃度，一般為0.5%~1%，有時(shí)可達(dá)2%。經(jīng)121℃20~30min滅菌，容易水解變質(zhì)，特別是在堿性溶液中更易破壞。

故糖（醇）發(fā)酵培養(yǎng)基常用高壓蒸115℃15min滅菌。

應(yīng)用的糖（醇）種類很多：

單糖：葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、果糖、木膠糖、半乳糖；

雙糖：乳糖、麥芽糖、蔗糖、覃糖；

多糖：菊糖、肝糖、糊精、淀粉；

醇：甘露醇、衛(wèi)矛醇、山梨醇、側(cè)金盞花醇、肌醇、丙三醇（甘油）；

糖苷：水楊苷等。

最常用的指示劑有酚紅、溴麝香草酚藍(lán)、溴甲酚紫、酸性復(fù)紅。

前兩者顏色反應(yīng)較敏感，但穩(wěn)定性差，后二者比較穩(wěn)定。特別是一些遲緩發(fā)酵的細(xì)菌，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)，應(yīng)用后二者指示劑。

酚紅pH6.8（黃色）~pH8.4（紅色）

1.2 甲基紅試驗(yàn)（methyl red）

甲基紅指示劑變色范圍是pH4.4（紅色）~pH6.2（黃色），產(chǎn)氣腸桿菌分解葡萄糖產(chǎn)生丙酮酸，但又很快將丙酮酸脫羧，轉(zhuǎn)化成醇等物質(zhì)，則培養(yǎng)液的pH值仍在6.2以上，故此時(shí)加入甲基紅指示劑，培養(yǎng)液呈黃色，此為陰性對(duì)照菌。陽(yáng)性對(duì)照菌是大腸埃希氏菌，呈現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。

1.3 V-P試驗(yàn)

伏-普試驗(yàn)，目的是檢查細(xì)菌是否能分解葡萄糖，產(chǎn)生乙酰甲基甲醇。

陽(yáng)性對(duì)照菌是產(chǎn)氣腸桿菌，分解葡萄糖（被檢細(xì)菌接種到葡萄糖蛋白胨水中，36℃18~24h）產(chǎn)生丙酮酸，再將丙酮酸脫羧形成乙酰甲基甲醇，在堿性條件下（乙液-40%KOH溶液），被氧化為二乙酰，與培養(yǎng)基蛋白胨中精氨酸等所含的胍基結(jié)合，通常在10min內(nèi)形成紅色化合物。

若不顯色，放置于50℃水浴2h，或放置于37℃培養(yǎng)箱中4h，充分搖動(dòng)，觀察培養(yǎng)液反應(yīng)結(jié)果，不顯紅色為陰性，陰性對(duì)照菌是大腸埃希氏菌。

1.4 ONPG試驗(yàn)

鄰硝基酚-β-D-半乳糖苷的縮寫(xiě)，利用該試劑可以檢查被檢細(xì)菌有無(wú)β-半乳糖苷酶和滲透酶，發(fā)酵乳糖的細(xì)菌具有這兩種酶。

滲透酶將乳糖分子帶入菌細(xì)胞內(nèi)，而β-半乳糖苷酶可將乳糖的β-半乳糖苷鏈切斷，產(chǎn)生葡萄糖和半乳糖。

遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，缺乏滲透酶，而ONPG滲入菌細(xì)胞內(nèi)，被β-半乳糖苷酶分解產(chǎn)生鄰位硝基苯酚，一般在20~30min內(nèi)顯黃色，為陽(yáng)性，對(duì)照菌為枸櫞酸鹽桿菌和亞利桑那菌。

方法：將被檢細(xì)菌接種到1%的乳糖肉湯瓊脂培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)過(guò)夜。取菌苔接種于0.25ml生理鹽水中做成懸液。加入1滴甲苯，并充分振搖，使酶釋放。在懸液中再加入ONPG液0.25ml，混勻，置于37℃培養(yǎng)箱或水浴箱中，分別在20min和3h后觀察培養(yǎng)液反應(yīng)結(jié)果不出現(xiàn)黃色者為陰性，對(duì)照菌是沙門(mén)氏菌。

1.5 氧化發(fā)酵試驗(yàn)

測(cè)定糖類的氧化或發(fā)酵及糖類未被利用的代謝類型。

氧化型：細(xì)菌在分解葡萄糖過(guò)程中，必須有氧分子參加。無(wú)氧環(huán)境中不能分解葡萄糖。

發(fā)酵型：在分解葡萄糖的過(guò)程中，可以進(jìn)行無(wú)氧降解。發(fā)酵型細(xì)菌無(wú)論在有氧或無(wú)氧的環(huán)境中都能分解葡萄糖。

產(chǎn)堿型：不分解葡萄糖的細(xì)菌。

將待檢菌同時(shí)穿刺接種兩支HL培養(yǎng)基，其中一支培養(yǎng)基滴加無(wú)菌的液體石蠟油，高度不少于1cm，37℃培養(yǎng)48h或更長(zhǎng)，觀察反應(yīng)結(jié)果。

培養(yǎng)基變黃色為產(chǎn)酸。

兩支培養(yǎng)基均產(chǎn)酸為發(fā)酵型細(xì)菌，僅不加石蠟的培養(yǎng)基產(chǎn)酸的是氧化型細(xì)菌，兩支培養(yǎng)基均不變化的為產(chǎn)堿型細(xì)菌。

二、蛋白質(zhì)、氨基酸及含氮化物代謝試驗(yàn)

2.1 苯丙氨酸脫氨酶試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌具有苯丙氨酸脫氨酶，可使苯丙氨酸脫氨形成苯丙酮酸，苯丙酮酸與三氯化鐵發(fā)生螯合作用，形成綠色絡(luò)合物。

方法：將被檢細(xì)菌的斜面培養(yǎng)物（先增菌）大量移種到苯丙氨酸瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)18-24h，再?gòu)男泵嫔系渭?0%三氯化鐵溶液4-5滴，使其自斜面培養(yǎng)物上緩緩流下，觀察結(jié)果。

結(jié)果：溶液出現(xiàn)綠色為陽(yáng)性，對(duì)照菌是變形桿菌；不變色為陰性，對(duì)照菌是產(chǎn)氣腸桿菌。

2.2 脫羧酶試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌具有某種氨基酸的脫羧酶，可使氨基酸脫去羧基產(chǎn)生胺和二氧化碳，胺使pH值>7，此時(shí)指示劑溴麝香草酚藍(lán)由綠色變?yōu)樗{(lán)色。

溴麝香草酚藍(lán)酸性顯黃色，堿性顯紫色。

方法：將被檢細(xì)菌接種到兩支脫羧酶培養(yǎng)基中，其中一支不加氨基酸，另一支加賴氨酸/精氨酸/鳥(niǎo)氨酸，再在培養(yǎng)基上覆蓋一層滅菌的液體石蠟，37℃培養(yǎng)18-24h，觀察結(jié)果。

結(jié)果：兩管培養(yǎng)基均含有葡萄糖，產(chǎn)酸，溴麝香草酚藍(lán)由藍(lán)變黃。含有氨基酸的一管出現(xiàn)脫羧基降解作用，產(chǎn)生堿性反應(yīng)，溴麝香草酚藍(lán)再由黃變藍(lán)，為陽(yáng)性。

鳥(niǎo)氨酸陰性對(duì)照菌為陰溝腸桿菌，顯黃色。

2.3 靛基質(zhì)（吲哚）試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌能分解蛋白胨中的色氨酸，產(chǎn)生靛基質(zhì)（吲哚），靛基質(zhì)與對(duì)二甲氨基苯甲醛結(jié)合，形成玫瑰紅色化合物。

方法：將被檢細(xì)菌接種到胰蛋白胨水培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24-48h后，滴加數(shù)滴試劑于培養(yǎng)基液面，輕輕搖動(dòng)（不可劇烈振動(dòng)），觀察結(jié)果。

結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，對(duì)照菌是大腸埃希氏菌；出現(xiàn)黃色為陰性，對(duì)照菌是產(chǎn)氣腸桿菌。

2.4 硫化氫試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌能分解含硫的氨基酸（胱氨酸、半胱氨酸等），產(chǎn)生硫化氫，硫化氫與培養(yǎng)基中的鉛鹽或鐵鹽反應(yīng)，形成黑色沉淀硫化鉛或硫化鐵。

方法：將被檢細(xì)菌以接種針穿刺接種于醋酸鉛或雙糖鐵培養(yǎng)基（乳糖+葡萄糖）中，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

結(jié)果：有黑色出現(xiàn)為陽(yáng)性。

說(shuō)明：在硫化氫試驗(yàn)的培養(yǎng)基加入硫代硫酸鈉的作用是還原作用，以保持培養(yǎng)基處于還原狀態(tài)，是產(chǎn)生的硫化氫不被氧化。

產(chǎn)硫化氫較少的菌種可在試管口放置醋酸鉛試條。

2.5 尿素酶試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌具有尿素酶，在含有尿素的培養(yǎng)基中，分解尿素產(chǎn)生氨，使培養(yǎng)基呈堿性，此時(shí)培養(yǎng)基中的酚紅指示劑顯紅色。

方法：將被檢細(xì)菌接種的尿素固體斜面培養(yǎng)基上，36℃培養(yǎng)4h檢查一次，再每天檢查一次，培養(yǎng)5天，觀察結(jié)果。

結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性，對(duì)照菌為變形桿菌；變色為陰性，對(duì)照菌是大腸埃希氏菌。

三、枸櫞酸鹽利用試驗(yàn)

原理：枸櫞酸鹽培養(yǎng)基系一綜合性培養(yǎng)基，其中枸櫞酸鈉為碳的唯一來(lái)源，磷酸二氫銨是氮的唯一來(lái)源。有的細(xì)菌能利用枸櫞酸鈉為碳源，能在培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，并且能分解枸櫞酸鹽，最后產(chǎn)生碳酸鹽，使培養(yǎng)基變?yōu)閴A性。培養(yǎng)基中的溴麝香草酚藍(lán)指示劑由綠色變?yōu)樯钏{(lán)色。不能利用枸櫞酸鹽為碳源的細(xì)菌在該培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，培養(yǎng)基不變色。

方法：將被檢細(xì)菌的菌懸液（挑取菌苔后，洗至生理鹽水中）接種到枸櫞酸鹽培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h，觀察結(jié)果。

結(jié)果：培養(yǎng)基上有菌生長(zhǎng)，培養(yǎng)基變?yōu)樯钏{(lán)色為陽(yáng)性，對(duì)照菌是產(chǎn)氣腸桿菌；若培養(yǎng)基不變色，則繼續(xù)培養(yǎng)7天，培養(yǎng)基仍不變色者為陰性，對(duì)照菌為大腸桿菌。

四、呼吸酶類試驗(yàn)

4.1 氧化酶試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌具有氧化酶，能將二甲基對(duì)苯二胺或四甲基對(duì)苯二胺試劑氧化（先使細(xì)胞色素C氧化，電子傳遞體）成紅色醌類化合物。

方法：取白色潔凈濾紙蘸取待測(cè)菌落，加鹽酸二甲基對(duì)苯二胺溶液1滴；Ewing氏改進(jìn)法，再加α-萘酚溶液1滴。

結(jié)果：陽(yáng)性者立即出現(xiàn)粉紅色，并逐漸加深，變?yōu)榈仙?，再到深紫色，Ewing氏改進(jìn)法陽(yáng)性于0.5min內(nèi)呈現(xiàn)鮮藍(lán)色，對(duì)照菌為綠膿桿菌（銅綠假單細(xì)胞菌）；陰性者顏色無(wú)變化，Ewing氏法陰性為2min內(nèi)不變色，對(duì)照菌為大腸桿菌。

1%鹽酸二甲基對(duì)苯二胺溶液要避免接觸含鐵物質(zhì)，防止出現(xiàn)假陽(yáng)性反應(yīng)。此試劑應(yīng)少量新鮮配制，于冰箱內(nèi)避光保存，也可購(gòu)置氧化酶試條。

該實(shí)驗(yàn)用于分辨革蘭氏陰性桿菌中的腸桿菌科（陰性）與弧菌科（陽(yáng)性）。

4.2 觸酶活力試驗(yàn)

原理：具有觸酶的細(xì)菌能催化過(guò)氧化酶，放出生態(tài)氧，繼而形成氧分子，出現(xiàn)氣泡。

方法：取3%過(guò)氧化氫0.5ml，滴加到不含血液的被檢細(xì)菌瓊脂培養(yǎng)物上，或滴加到不含血液的肉湯培養(yǎng)物中，觀察結(jié)果。

結(jié)果：培養(yǎng)物出現(xiàn)氣泡者為陽(yáng)性。

說(shuō)明：過(guò)氧化氫濃度過(guò)高（30%）會(huì)產(chǎn)生氣泡出現(xiàn)假陽(yáng)性；血液中含有觸酶，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

4.3 硝酸鹽還原試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌能將培養(yǎng)基中的硝酸鹽還原為亞硝酸鹽，亞硝酸鹽與醋酸作用生成亞硝酸，亞硝酸與試劑中的對(duì)氨基苯磺酸作用生成重氮苯磺酸，再與α-萘胺結(jié)合，生成N-α-萘胺偶氮苯磺酸（紅色）。

方法：將被檢細(xì)菌接種于硝酸鹽培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)1~4天，每天吸取培養(yǎng)物2ml，加甲液（對(duì)氨基苯磺酸0.8g，5mol/L醋酸100ml）和乙液（α-萘胺0.5g，5mol/L醋酸100ml）各數(shù)滴，同時(shí)以為接種細(xì)菌的培養(yǎng)基作對(duì)照，觀察結(jié)果。

結(jié)果：出現(xiàn)紅色為陽(yáng)性。

說(shuō)明：亞硝酸鹽在自然界分布很廣，容易污染試劑，硝酸鹽不純或保管不妥也可能含有亞硝酸鹽，因此必須做空白對(duì)照；繁殖迅速而還原硝酸鹽能力強(qiáng)的細(xì)菌如果培養(yǎng)時(shí)間過(guò)久，可能將亞硝酸鹽全部分解為氨和氮，出現(xiàn)假陰性反應(yīng)，故需每天試驗(yàn)，空白對(duì)照。

五、毒性酶類試驗(yàn)

5.1 溶血試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌在代謝過(guò)程中，產(chǎn)生溶血素，能使人或動(dòng)物的紅細(xì)胞發(fā)生溶解。

方法：

1）平板法：將被檢細(xì)菌接種到血液瓊脂平板培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)24h。

2）試管法：取被檢細(xì)菌16-18h肉湯培養(yǎng)物若干，加等量經(jīng)生理鹽水洗滌三次的2%羊紅細(xì)胞懸液，置于37℃水浴箱中，30min后觀察結(jié)果。

結(jié)果：

1）平板法：若菌落周圍出現(xiàn)透明的溶血環(huán)，為完全溶血（β溶血），菌落周圍出現(xiàn)綠色溶血環(huán)，為不完全溶血（α溶血），無(wú)溶血環(huán)為不溶血（γ溶血）。

2）試管法：液體澄清透明為溶血，陽(yáng)性。

5.2 鏈激酶試驗(yàn)

原理：A群鏈球菌在代謝過(guò)程中，產(chǎn)生鏈激酶，能激活血液中的纖維蛋白酶原為溶纖維蛋白酶，促使纖維蛋白凝塊溶解。

方法：取血漿0.2ml，放入滅菌小試管中，加無(wú)菌生理鹽水0.8ml，再加被檢細(xì)菌18-24h肉湯培養(yǎng)物0.5ml，充分混勻后，再加入0.25%氯化鈣水溶液0.25ml，置于37℃水浴中，觀察結(jié)果。

結(jié)果：10min內(nèi)血漿先凝固，而后又開(kāi)始溶解，溶解時(shí)間與鏈激酶含量成正比。鏈激酶含量多時(shí)，20min內(nèi)凝固的血漿完全溶解。如無(wú)變化，應(yīng)在水浴中持續(xù)2h、24h，分別觀察結(jié)果。血漿凝塊完全溶解者為陽(yáng)性，時(shí)間越短表明毒性越強(qiáng)。24h血凝塊仍不溶解者為陰性。

5.3 血漿凝固酶試驗(yàn)

原理：某些細(xì)菌能產(chǎn)生血漿凝固酶，分兩種，一種結(jié)合在細(xì)菌細(xì)胞壁上，遇到血漿直接作用于血漿的纖維蛋白，使細(xì)菌凝成顆粒狀，使用玻片法；另一種分泌到細(xì)菌細(xì)胞外，稱為游離血漿凝固酶，能使血漿中的纖維蛋白原變?yōu)槔w維蛋白，使用試管法試驗(yàn)。

方法：

1）玻片法：取生理鹽水2滴，分別滴于載玻片上，以接種環(huán)挑取被檢細(xì)菌菌落，放在2滴生理鹽水中，研磨成濃菌懸液。在1滴懸液中加1滴未稀釋的血漿，另一滴加入1滴生理鹽水作為對(duì)照，迅速搖動(dòng)，觀察結(jié)果。

2）試管法：取3支小試管，每支加1:4稀釋的新鮮血漿0.5ml，其中1支加被檢細(xì)菌生理鹽水懸液或肉湯培養(yǎng)物0.5ml，另一支加陽(yáng)性菌株生理鹽水懸液或肉湯培養(yǎng)物0.5ml作陽(yáng)性對(duì)照，再一支加生理鹽水或肉湯培養(yǎng)液0.5ml作陰性對(duì)照。3支試管置于37℃水浴箱中，每隔30min觀察一次結(jié)果。

結(jié)果：

1）玻片法：若在加血漿的1滴中迅速出現(xiàn)凝固顆粒，在加生理鹽水對(duì)照的1滴中未出現(xiàn)凝固顆粒，為陽(yáng)性；若超過(guò)2min才開(kāi)始出現(xiàn)凝固顆粒者不作陽(yáng)性（多為非致病性）。

2）試管法：6h內(nèi)，若試驗(yàn)管和陽(yáng)性對(duì)照管出現(xiàn)凝固，陰性對(duì)照管不出現(xiàn)凝固，為陽(yáng)性；多數(shù)陽(yáng)性細(xì)菌在0.5-1h內(nèi)發(fā)生凝固。

六、嗜鹽試驗(yàn)

原理：在高于3%的氯化鈉培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)不好，但能在無(wú)言培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的，稱為非嗜鹽菌，如腸桿菌科。能在3%-6%氯化鈉培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，但在無(wú)鹽培養(yǎng)基上不生長(zhǎng)，稱為嗜鹽菌，如副溶血性弧菌。在無(wú)鹽和高鹽培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)，但長(zhǎng)得不茂盛，稱為耐鹽菌，如葡萄球菌、銅綠假單細(xì)胞菌。

方法：取被檢細(xì)菌分別接種到1支無(wú)鹽葡萄糖蛋白胨水和一支5%-6%氯化鈉葡萄糖蛋白胨水中，37℃培養(yǎng)6-24h，觀察生長(zhǎng)情況。

結(jié)果：培養(yǎng)物出現(xiàn)渾濁生長(zhǎng)為陽(yáng)性。