21世紀(jì)是以分子生物學(xué)為代表的生命科學(xué)的時(shí)代，近年來(lái),隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的快速發(fā)展,人類(lèi)基因組計(jì)劃的完成,尤其是生物化學(xué)、免疫學(xué)、生物儀器及計(jì)算機(jī)理論與技術(shù)的進(jìn)步，分子生物學(xué)技術(shù)在醫(yī)學(xué)、遺傳學(xué)、法醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域廣泛應(yīng)用, 新的診斷技術(shù)和方法不斷涌現(xiàn)并被廣泛應(yīng)用于微生物檢測(cè)，為傳染病的流行病學(xué)調(diào)查、基yin的多樣性、微生物的生物學(xué)特性、微生物的致病性和藥物的耐受性、微生物的生物降解能力等各個(gè)方面提供了重要的信息。 一、核酸雜交法

初應(yīng)用于微生物檢測(cè)的分子生物學(xué)技術(shù)是基因探針?lè)椒?它是用帶有同位素標(biāo)記或非同位素標(biāo)記的DNA 或RNA pian段來(lái)檢測(cè)樣本中某一特定微生物核苷酸的方法。核酸雜交有原位雜交、打點(diǎn)雜交、斑點(diǎn)雜交、Sorthern雜交、Northern雜交等,核酸分子探針又可根據(jù)它們的來(lái)源和性質(zhì)分為DNA探針、cDNA探針、RNA探針及人工合成的寡聚核苷酸探針等。其原理是通過(guò)標(biāo)記根據(jù)病原體核酸片段制備的探針與病原體核酸片段雜交,觀察是否產(chǎn)生特異的雜交信號(hào)。核酸探針技術(shù)具有特異性好、敏感性高、診斷速度快、操作較為簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。目前,已建立了多種病原體的核酸雜交檢測(cè)方法,尤其是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光原位雜交技術(shù)(FISH) 更為常用。

二、質(zhì)粒DNA圖譜分型技術(shù)

細(xì)菌質(zhì)粒分析是較早被使用的對(duì)病原微生物流行病學(xué)進(jìn)行調(diào)查的分子分型技術(shù)。這種技術(shù)包括萃取質(zhì)粒DNA ,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA。由于不同菌株質(zhì)粒DNA序列和大小不同,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳分離得到的DNA質(zhì)粒圖譜也將不同,因此,與流行病相關(guān)的分離株能夠被分類(lèi)分型。質(zhì)粒圖譜分析的再現(xiàn)性和分辨力可通過(guò)限制性?xún)?nèi)切酶消化質(zhì)粒而提高。雖然2個(gè)不相關(guān)質(zhì)粒有相同的分子量, 但性?xún)?nèi)切酶位點(diǎn)的位置和頻率是不同的。但質(zhì)粒是可移動(dòng)的非染色體遺傳物質(zhì),細(xì)菌能自發(fā)的失去或很容易的獲得,結(jié)果流行病相關(guān)的菌株可以展示不同質(zhì)粒指紋圖譜。許多質(zhì)粒帶有抗性決定因子的基因,存在于轉(zhuǎn)位子上,而轉(zhuǎn)位子很容易丟失或獲得,這同樣可以迅速改變質(zhì)粒DNA組成。產(chǎn)生圖譜的再現(xiàn)性也會(huì)由于質(zhì)?？臻g存在的不一致性(超螺旋的、斷口的和線形的)而被影響,而凝膠電泳時(shí)具有不同遷移速度。大多數(shù)病原微生物有質(zhì)粒,但沒(méi)有質(zhì)粒的就不能用此技術(shù)分型。此外,由于有些分離株中含有1個(gè)或2個(gè)質(zhì)粒,會(huì)使菌株間的分辨力降低。

三、染色體DNA 限制性?xún)?nèi)切酶分析技術(shù)

染色體DNA經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶消化,消化后的片段再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分離。用限制性?xún)?nèi)切核酸酶BglⅡ和EcoRI等消化病原微生物基因組DNA可以產(chǎn)生大量短的片段。電泳后,將獲得一系列被分離的DNA圖譜。通過(guò)比較圖譜,就可以進(jìn)行菌相似性研究。幾乎所有的病原微生物分離株都可以通過(guò)這種方法分型,但由于基因組DNA巨大,酶切后產(chǎn)生的片段眾多,且含有大量的重疊片段,這將導(dǎo)致菌株間圖譜一致性分析產(chǎn)生困難。但若細(xì)菌只含一個(gè)或少量核糖體操縱子, 則只產(chǎn)生1～ 2條帶, 這限制區(qū)分密切相關(guān)菌株的能力。RFLP分析分辨力低于脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)（PFGE）, 且比較復(fù)雜圖譜(數(shù)百條帶) 的難度較大。

四、DNA 的脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)

脈沖場(chǎng)凝膠電泳分型技術(shù)（PFGE）是使用對(duì)染色體有很少酶切位點(diǎn)的限制性核酸內(nèi)切酶消化細(xì)菌DNA ,產(chǎn)生大的DNApian段(10～800 kb) ,這些大片段不能通過(guò)常規(guī)電泳方法進(jìn)行有效分離。在電場(chǎng)方向周期改變(脈沖)的凝膠電泳條件下,DNApian段根據(jù)大小有效分離。PFGE產(chǎn)生的染色體DNA圖譜比用那些高頻率切割的限制性?xún)?nèi)切酶產(chǎn)生的圖譜更為簡(jiǎn)單清晰。理論上,所有的細(xì)菌都能使用PFGE 進(jìn)行分型分類(lèi),結(jié)果具有極高的再現(xiàn)性和分辨率, 常作為分子生物學(xué)分型方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”使用。PFGE 也有一些局限,例如所需時(shí)間長(zhǎng),使用的試劑非常昂貴,要求專(zhuān)門(mén)的儀器等。另外,很小的電泳條件的不同就可以改變每條光譜帶間距離,使用不同凝膠進(jìn)行電泳得到的結(jié)果也比較復(fù)雜,這為不同實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果比較帶來(lái)一定麻煩。

五、聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)

聚合酶鏈反應(yīng)( PCR)技術(shù)自1985年發(fā)明以來(lái),因其高度靈敏性和良好的特異性受到了人們的高度重視,各種各樣以PCR 為基礎(chǔ)的DNA序列的擴(kuò)增和檢測(cè)方法得到了迅猛發(fā)展,幾乎已應(yīng)用于基礎(chǔ)研究的各個(gè)領(lǐng)域。各種衍生技術(shù)如反轉(zhuǎn)錄PCR ( RTR) 、多重PCR 、巢式PCR、PCR單鏈構(gòu)象多態(tài)性(PCRSSCP)、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA 技術(shù)(RAPD)和重復(fù)序列PCR技術(shù)(Rep - PCR)、熒光定量PCR等。其中定量PCR 既可以用于臨床感染性疾病的診斷,又可用于監(jiān)測(cè)其療效，PCR及其衍生的技術(shù)近年來(lái)在病原微生物分型研究上得到了廣泛應(yīng)用。

1、隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA 技術(shù)

隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA 技術(shù)（RAPD）是一種典型PCR衍生技術(shù), 在低復(fù)性溫度下用短任意序列引物( 10～15m ers) 擴(kuò)增有密切同源性的基因組DNA序列, 模板上任意引物雜交點(diǎn)的數(shù)目和位置因種的不同株而異, 理論上特定株形成特定圖譜?；蚪M在這些雜交區(qū)段如發(fā)生了DNApian段缺失、插入或堿基突變,就可能導(dǎo)致這些特定結(jié)合位點(diǎn)分布發(fā)生相應(yīng)的變化。通過(guò)電泳對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物DNApian段的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)、分析就可以反應(yīng)出不同菌株基因組的DNA特點(diǎn),從而對(duì)他們進(jìn)行分型，RAPD是目前zuijiandan的DNA分型方法, 分辨力高于RFLP, 但低于Rep－PCR，RAPD技術(shù)的使用范圍也非常廣,分辨結(jié)果也有較好的實(shí)驗(yàn)室再現(xiàn)性。雖然RAPD技術(shù)簡(jiǎn)單、快速, 但由于其對(duì)引物和DNA濃度、DNA模板質(zhì)量、凝膠電泳和DNA聚合酶類(lèi)型的變化高度敏感, 故RAPD的重復(fù)性不夠理想。雖然RAPD的分型結(jié)果在不同實(shí)驗(yàn)室間變化較大,分辨力不如PFGE技術(shù),但在疾病暴發(fā)流行時(shí),PAPD仍是一種分析相關(guān)菌株和排除不相關(guān)菌株的良好技術(shù)。

2、重復(fù)序列PCR技術(shù)

重復(fù)序列PCR技術(shù)（Rep－PCR是利用細(xì)菌基因組中廣泛分布的短重復(fù)序列為引物靶序列,進(jìn)行PCR擴(kuò)增,通過(guò)對(duì)PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果的比較,分析菌株間基因組存在的差異。這些重復(fù)序列在原核生物界廣泛存在,在一些細(xì)菌屬和種中是保守的。在這種方式獲得的圖譜中,光譜帶的大小和數(shù)量的不同代表著不同菌株重復(fù)序列間的距離和重復(fù)序列的數(shù)量。已成功地用于分型的細(xì)菌重復(fù)DNA序列有腸道菌重復(fù)基因間共有(ERIC) 序列、重復(fù)基因外回紋序列(REP)和BOX序列的分析，與其他分類(lèi)技術(shù)相比,這種技術(shù)有更高的分辨力。研究表明,雖然有時(shí)Rep-PCR分辨力稍低,但與PFGE獲得的結(jié)果卻有很好的相關(guān)性。

3、免疫PCR

免疫PCR(immuno polymerase chain reaction ,IM PCR) 是1992 年Sano 等建立的一種檢測(cè)微量抗原的高靈敏度技術(shù)。該技術(shù)把抗原抗體反應(yīng)的高特異性和聚合酶鏈反應(yīng)的高敏感性有機(jī)結(jié)合在一起,它的基本原理是用一段已知DNA分子標(biāo)記抗體作為探針,用此探針與待測(cè)抗原反應(yīng), 用PCR擴(kuò)增粘附在抗原抗體復(fù)合物上的這段DNA分子,電泳定性,根據(jù)特異性PCR產(chǎn)物的有無(wú),來(lái)判斷待測(cè)抗原是否存在。目前,國(guó)內(nèi)外報(bào)道的免疫PCR的敏感性一般比現(xiàn)行的ELISA 法高102 ～105 倍。由于PCR產(chǎn)物在抗原量未達(dá)到飽和前與抗原抗體復(fù)合物的量成正比,因此免疫PCR 還可用于抗原的半定量試驗(yàn)。

PCR－ELISA是PCR與ELISA技術(shù)結(jié)合的檢測(cè)方法，其綜合了PCR、分子雜交和ELISA三種技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)，主要用于檢測(cè)樣品中的特定基因。它引入digaoxing(或生物素) 標(biāo)記的dNTP或引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,利用酶標(biāo)抗digaoxing抗體(或酶標(biāo)記親和素) 進(jìn)行ELISA檢測(cè),代替了用于常規(guī)PCR產(chǎn)物檢測(cè)的電泳方法,方便快捷,易于處理大量樣品,且其靈敏度比使用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)方法高100倍,當(dāng)有適當(dāng)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)品時(shí),還可進(jìn)行定量測(cè)定。

六、DNA 序列測(cè)定

與檢測(cè)全染色體的PFGE、Rep－PCR和RAPD分析相比,DNA測(cè)序只檢測(cè)細(xì)菌或真菌株間潛在變化序列的很小一部分。用于辨別菌株的被測(cè)序DNA區(qū)域必須滿足以下條件:DNA區(qū)的結(jié)構(gòu)必須是可變序列，兩側(cè)為高度保守區(qū);DNA序列的可變性必須能足以區(qū)分特定種的不同株;DNA序列不能水平轉(zhuǎn)移到其它株。對(duì)細(xì)菌和真菌, 極少序列滿足這些條件。相反,DNA測(cè)序被認(rèn)為是病毒分型的 “金標(biāo)準(zhǔn)” 。DNA測(cè)序費(fèi)用高、需要很高的技術(shù)條件, 而且自動(dòng)化DNA 測(cè)序儀十分昂貴。

七、基于16SrRNA的檢測(cè)技術(shù)

自Woese 等于1987年*運(yùn)用rRNA分析以來(lái),rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)快速擴(kuò)大起來(lái),成為研究細(xì)菌多樣性、進(jìn)化、系統(tǒng)發(fā)育中被廣泛采用的序列。16SrRNA存在于所有原核生物細(xì)胞中,它們相對(duì)穩(wěn)定且有較高的拷貝數(shù)(每個(gè)細(xì)胞幾千個(gè)拷貝) ,其序列中含可變區(qū)及高度保守區(qū),因此可設(shè)計(jì)群、屬、種特異性的探針?，F(xiàn)階段各種常見(jiàn)細(xì)菌的16SrRNA基因幾乎全部測(cè)序完成,16S rRNA編碼基因的這些特點(diǎn)使之成為較理想的細(xì)菌基因分類(lèi)的靶序列,逐漸成為細(xì)菌鑒定、分類(lèi)的“金標(biāo)準(zhǔn)”。目前, 16SrRNA 檢測(cè)技術(shù)已在醫(yī)學(xué)界得到廣泛應(yīng)用,可以用現(xiàn)有病原菌標(biāo)準(zhǔn)菌株制作DGGE(變性梯度凝膠電泳) 標(biāo)準(zhǔn)marker , 然后對(duì)疑似“病原菌”擴(kuò)增16SrRNA進(jìn)行DGGE分析,這樣可以做到快速檢測(cè)。

八、生物芯片

生物芯片技術(shù)是將生物大分子,如寡核苷酸、cDNA、基因組DNA、肽、抗原以及抗體等固定在諸如硅片、玻璃片、塑料片、凝膠和尼龍膜等固相介質(zhì)上形成生物分子點(diǎn)陣,當(dāng)待測(cè)樣品中的生物分子與生物芯片的探針?lè)肿影l(fā)生雜交或相互作用后,利用激光共聚焦顯微掃描儀對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行檢測(cè)和分析。微生物檢測(cè)基因芯片是指用來(lái)檢測(cè)樣品中是否含有微生物目的核酸片段的芯片?；诟咄?、微型化和平行分析的特點(diǎn),微生物檢測(cè)基因芯片在微生物病原體檢測(cè)、種類(lèi)鑒定、功能基因檢測(cè)、基因分型、突變檢測(cè)、基因組監(jiān)測(cè)等研究領(lǐng)域中發(fā)揮著越來(lái)越重要的作用。目前,許多細(xì)菌、病毒等病原體的基因組測(cè)序已經(jīng)完成,將許多代表各種微生物的特殊基因制成1張芯片,經(jīng)反轉(zhuǎn)錄就可檢測(cè)樣本中有無(wú)病原體基因的表達(dá)及表達(dá)水平,由此判斷病人感染病原、感染進(jìn)程以及宿主反應(yīng)等。這樣就大大提高了檢測(cè)效率?；蛐酒\斷病原菌的原理基于細(xì)菌的16SrRNA基因的高度保守性,由于RNA易于降解,因此多采用檢測(cè)16SrRNA 所對(duì)應(yīng)染色體上的16SrDNA序列。對(duì)16SrDNA而言,如果出現(xiàn)3個(gè)堿基以上的差異就可以斷定細(xì)菌不屬于同一種屬,因此可用于細(xì)菌的分類(lèi)和鑒別。對(duì)病毒和耐藥性病原菌的檢測(cè)是通過(guò)將待測(cè)的特定基yin(bing毒特異性基因和耐藥基因) 經(jīng)體外轉(zhuǎn)錄、PCR、逆轉(zhuǎn)錄、末端標(biāo)記等處理成標(biāo)記有熒光分子的核酸分子,然后與芯片上的探針進(jìn)行雜交,用計(jì)算機(jī)對(duì)雜交信號(hào)進(jìn)行處理,依信號(hào)和強(qiáng)度即可得出核酸含量。

液態(tài)芯片（Suspension Array Technology，SAT），又稱(chēng)微球蛋白芯片（Protein Bead arrays，PBA），是近年來(lái)出現(xiàn)的一種新的芯片技術(shù)，也是weiyi被美國(guó)食品和*（FDA）批準(zhǔn)的用于臨床診斷的生物芯片。其原理是用兩種熒光染料按照不同比例將直徑為5.6um的微球（beads/microfluorospheres）染成100種染色，每種顏色的微球共價(jià)結(jié)合一種生物探針，可以是抗原、抗體、配體，也可以是核酸或酶，分別針對(duì)一種待檢物?；旌陷d有100種不同顏色的微球，就可以在一個(gè)反應(yīng)孔里同時(shí)完成100種不同的生物反應(yīng)。隨后微球成單列通過(guò)兩束激光照射的管道，計(jì)算機(jī)采集并處理每種顏色微球的熒光強(qiáng)度變化就可以分別對(duì)每個(gè)待測(cè)物進(jìn)行定性或定量的檢測(cè)，該系統(tǒng)可用于多種微生物抗原、抗體和特定基因的聯(lián)合檢測(cè)，與固態(tài)芯片相比，液態(tài)芯片在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)、反應(yīng)速度、檢測(cè)敏感性、穩(wěn)定性以及自動(dòng)化程度方面都有較大的優(yōu)越性，因此不少學(xué)者看好液態(tài)芯片的應(yīng)用前景。

九、生物傳感器

生物傳感器是將新興的傳感器技術(shù)和分子診斷技術(shù)相結(jié)合而成的一種新技術(shù),是現(xiàn)代臨床檢驗(yàn)診斷發(fā)展的一個(gè)新方向。由于生物傳感器檢測(cè)準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn),近年來(lái)已經(jīng)在許多領(lǐng)域取得了很大的進(jìn)展,在生物分子相互作用、藥物篩選、臨床診斷、食物檢測(cè)等領(lǐng)域獲得了廣泛的應(yīng)用，其中臨床中用于病原體檢測(cè)的以DNA生物傳感器zuiwei常見(jiàn)。盡管生物傳感器作為一種新的傳感元件近年來(lái)得到了很大的發(fā)展,許多光化學(xué)、電化學(xué)以及壓電晶體都相繼在生物傳感器中得到應(yīng)用。與常規(guī)的核酸和蛋白質(zhì)檢測(cè)相比,具有檢測(cè)準(zhǔn)確、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn),但由于它存在靈敏度不夠、容易受雜質(zhì)干擾等缺點(diǎn),隨著研究的進(jìn)一步深化和技術(shù)方法的改進(jìn),這些問(wèn)題將會(huì)得到解決。

十、蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)

蛋白質(zhì)指紋圖譜技術(shù)是隨著蛋白質(zhì)組學(xué)興起的一種新技術(shù)，其中表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜蛋白芯片技術(shù)(SELDI-TOF-MS，下稱(chēng)SELDI-TOF-MS) 是由T. William Hutchens 和 Tai-Tung Yip等科學(xué)家在上世紀(jì)90年代早期所創(chuàng)立的一種蛋白指紋圖譜分析技術(shù)，并獲得了2002年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)，為研究蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、屬性、功能提供了高效而可靠的技術(shù)平臺(tái)。其原理是利用各種方法（共價(jià)鍵、電荷等）將蛋白“富集”到芯片表面，在激光的轟擊下，蛋白解吸附并電離成帶電粒子，并在電場(chǎng)作用下飛行，其飛行單位距離的時(shí)間取決于其所帶電荷數(shù)量和其分子量之比（質(zhì)荷比），從而達(dá)到分離和分析蛋白質(zhì)的目的。該技術(shù)是目前zuiyou前途的比較蛋白質(zhì)組分析方法，為蛋白質(zhì)組學(xué)研究提供了一個(gè)利器，具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和能力：可直接用粗生物樣品（血清、尿、體液）進(jìn)行分析、可同時(shí)快速發(fā)現(xiàn)多個(gè)生物標(biāo)記物、具有高通量的驗(yàn)證能力、能發(fā)現(xiàn)低豐度蛋白質(zhì)（靈敏度高達(dá)fmol/ml），與“雙相電泳加飛行質(zhì)譜”相比，除了有相似功能外，并可增加測(cè)定疏水蛋白質(zhì)，可在同一系統(tǒng)中集發(fā)現(xiàn)和檢測(cè)為一體，SELDI在微生物檢驗(yàn)方面將發(fā)揮重要的作用。

十一、適體技術(shù)

1990年,Tuerk和Gold[1]分別獨(dú)立研制了一種新型的體外篩選技術(shù),即指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(Systematic evolution of ligand by exponential enrichment, SELEX),用于研究小分子核酸與靶物質(zhì)相結(jié)合的部位、序列及空間構(gòu)像。適體（aptamer），又稱(chēng)適配分子或適配子，實(shí)質(zhì)是運(yùn)用SELEX技術(shù)從人工體外合成的隨機(jī)寡核苷酸序列庫(kù)中反復(fù)篩選得到的能以極高的親和力和特異性與靶分子結(jié)合的一段寡核苷酸序列。

由于適體分子可用酶、放射性核素、熒光物質(zhì)及生物素等標(biāo)記以作為檢測(cè)分子，它協(xié)同傳統(tǒng)的單克隆抗體在流式細(xì)胞技術(shù)、生物傳感器、熒光偏振、分子燈塔和毛細(xì)管電泳等檢測(cè)技術(shù)上得到了廣泛的運(yùn)用。

適體與抗體相比，具有針對(duì)靶分子的范圍廣、親和力和特異性高、性能穩(wěn)定、便于修飾等諸多優(yōu)點(diǎn)。利用針對(duì)微生物的特定蛋白和基因的適體對(duì)微生物進(jìn)行鑒定和分型以及耐藥基因的檢測(cè)方面，適體將具有良好的前景，有的學(xué)者認(rèn)為，未來(lái)適體有可能取代抗體。

十二、結(jié)語(yǔ)

長(zhǎng)期以來(lái),人們?cè)噲D找到一種既簡(jiǎn)便又快速、又有足夠分辨力的技術(shù)來(lái)鑒別和區(qū)分各種病原微生物，各種新方法和新技術(shù)不斷涌現(xiàn)，但每一種方法都有其局限性，為了彌補(bǔ)各自的不足，使用一種以上的技術(shù)即采用多種方法聯(lián)合使用的策略,一種技術(shù)的缺點(diǎn)會(huì)被其他技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)所代替。選擇檢測(cè)方法應(yīng)考慮到自身所擁有的條件,檢測(cè)所要求達(dá)到的靈敏度,而提高靈敏度和去除假陽(yáng)性是檢測(cè)方法發(fā)展的趨勢(shì)。近年來(lái),隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展,臨床病原菌檢測(cè)將向著簡(jiǎn)便、快速、高通量、自動(dòng)化的方向發(fā)展。分子生物學(xué)技術(shù)通過(guò)自動(dòng)化儀器的使用,將在病原菌診斷、鑒定和耐藥基因檢測(cè)方面越來(lái)越廣泛地應(yīng)用于lin床。